论文部分内容阅读
[摘要] 目的 探究柠檬酸铁胺（FAC）对SH-SY5Y多巴胺能细胞系葡萄糖脑苷脂酶（GCase）活性及其蛋白表达的影响。方法 用FAC、GCase活性抑制剂环己烯四醇环氧化物（CBE）分别或共同处理细胞48 h，应用荧光法检测GCase活性，免疫印迹法检测GCase蛋白表达。结果 FAC和CBE两种因素共处理，对GCase活性及其蛋白表达的影响不存在交互作用（P>0.05）。FAC处理SH-SY5Y细胞后，GCase活性降低，蛋白表达升高，与对照组比较差异具有统计学意义（F=8.191、4.934，P<0.05）;CBE处理SH-SY5Y细胞后，GCase活性降低，蛋白表达升高，与对照组比较差异具有统计学意义（F=14.605、4.182，P<0.05）。结论 高铁可降低SH-SY5Y细胞中GCase的活性，升高蛋白的表达。
[关键词] 铁;柠檬酸盐类;葡糖苷酰鞘氨醇酶;SH-SY5Y细胞
[中图分类号] R338.1;R345.62 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532（2020）02-0143-04
doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.058 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200407.0930.004.html;2020-04-07 14：57
[ABSTRACT] Objective To explore the effect of ferric ammonium citrate （FAC） on glucocerebrosidase （GCase） activity and expression in SH-SY5Y dopaminergic cells. Methods SH-SY5Y dopaminergic cells were treated with FAC and the GCase inhibitor conduritol B epoxide （CBE）， alone or in combination， for 48 h. Fluorometric assay was used to determine the GCase acti-vity. Western blotting was performed to determine the expression level of GCase. Results When FAC and CBE were used in combination to treat the SH-SY5Y cells， there was no interaction between them with regard to the effect on GCase activity and expression （P>0.05）. SH-SY5Y cells treated with FAC alone showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=8.191，4.934，P<0.05）; SH-SY5Y cells treated with CBE alone also showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=14.605，4.182，P<0.05）. Conclusion High level of iron can decrease the activity and increase the expression level of GCase in SH-SY5Y cells.
[KEY WORDS] iron; citrates; glucosylceramidase; SH-SY5Y cells
近年来遗传基因的发现为家族性和散发性帕金森病（PD）的发病机制提供新见解，有5%～10%的PD病例是遗传因素所致[1-2]。临床研究发现，PD病人中编码葡萄糖脑苷酯酶（GCase）的基因GBA突变率达20%，因此GBA突變是目前已知的PD和相关突触核蛋白病发展的最常见的遗传危险因素[3-5]。GCase是一种具有497个氨基酸的膜相关性蛋白，该蛋白在内质网中合成和经糖基化修饰后，被溶酶体膜整合蛋白-2转运至溶酶体中，发挥生物学功能[6]。GCase活性的降低可以导致葡萄糖神经酰胺的聚积，进而导致戈谢病的发生[7]。在PD中，GBA突变降低了GCase的活性，导致α-突触核蛋白聚集，而聚集的α-突触核蛋白又进一步促进了GCase活性的降低，形成恶性循环，造成多巴胺能神经元的死亡，因此GCase的活性与PD的发病进程密切相关[8-12]。铁是PD发病的重要因素之一[13]，铁可以诱导氧化应激和铁死亡等[14-16]，从而造成多巴胺能神经元的选择性损伤。然而，目前关于铁对GCase活性及其蛋白表达的影响尚未见报道。因此，本研究应用柠檬酸铁铵（FAC）制备SH-SY5Y多巴胺能细胞系的高铁模型，并使用GCase的不可逆竞争性抑制剂环己烯四醇环氧化物（CBE）作为对照药，探讨铁对GCase活性及其蛋白表达的影响。现将结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 实验材料
SH-SY5Y细胞系由中国科学院上海细胞库提供，DMEM高糖基础培养液、胎牛血清（FBS）购自以色列BI公司，4-甲基伞形酮-β-葡萄糖苷（4-MU-β-GLC）、CBE、FAC和GCase一抗购自美国Sigma公司，β-actin抗体、HRP-IgG标记的二抗购自北京博奥森公司，ECL发光液为Millipore公司产品，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 SH-SY5Y细胞的培养
实验前将实验器具高压灭菌。从液氮中取出冻存的SH-SY5Y细胞转移到37 ℃水浴中迅速（30 s内）解冻，充分摇匀后置于离心机中，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入完全培养液吹打均匀后接种到25 cm2细胞培养瓶中，光镜下观察细胞是否贴壁，然后置于培养箱中（37 ℃、含体积分数0.05 CO2）培养，每隔2 d传代1次。
1.3 实验分组及处理
将SH-SY5Y细胞分为对照组（A组）、FAC处理组（B组）、CBE处理组（C组）、FAC和CBE共处理组（D组）。将SH-SY5Y细胞以2×104/cm2的密度接种于6孔板中，每孔加入1.5 mL的细胞混悬液。当细胞达到50%～70%融合时，对照组加入新鲜无血清的培养液;FAC处理组加入100 μmol/L的FAC;CBE处理组则加入100 μmol/L的CBE;FAC和CBE共处理组先加入100 μmol/L的CBE预孵育30 min，再加入100 μmol/L的FAC。上述各组药物处理时间均为48 h。
1.4 GCase酶活性的测定
药物处理48 h后每孔加入100 μL的磷酸盐缓冲液，于冰上静置30 min后用刮板刮下细胞并在细胞破碎仪中破碎，破碎强度为30%;在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min;取2.5 μL的上清，加入5 mmol/L的4-MU-β-GLC 12.5 μL，37 ℃孵育30 min后，加入1 mol/L的甘氨酸缓冲液（pH值=10）终止反应。在酶标仪上设定激发光波长EX=360 nm、发射光波长Em=460 nm，检测产物4-甲基伞形酮的含量，以相对荧光单位（RFU）表示，并应用BCA蛋白定量试剂盒检测提取样品的蛋白浓度（RFU/μg总蛋白）。
1.5 免疫印迹法检测GCase蛋白表达
药物处理48 h后提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测提取蛋白的浓度，以每孔总蛋白量为20 μg计算蛋白上样量，加入Loading Buffer，95 ℃煮5 min。经120 g/L的SDS-PAGE凝胶电泳后湿转到0.45 μm 的PVDF膜上，室温下用100 g/L的脱脂奶粉溶液封闭2 h，再分别加入GCase（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗于4 ℃摇床过夜。第2天用山羊抗兔的HRP-IgG（1∶10 000）孵育1 h后以TBST溶液洗3次，每次10 min，ECL发光液显影后用Image J统计结果。
1.6 统计学处理
应用SPSS 22.0软件进行统计分析，实验结果以±s表示，针对FAC和CBE两种处理因素，采用析因设计的方差分析进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 FAC对GCase活性的影响
析因设计方差分析显示，FAC和CBE这两种因素对GCase活性的影响不存在交互作用（P>0.05），因此进一步分析FAC、CBE主效应的结果是否具有统计学意义。100 μmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，FAC处理组酶活性较对照组有明显的下降，差异有统计学意义（F=8.191，P<0.05）;在CBE处理SH-SY5Y细胞48 h后，CBE处理组酶活性也较对照组明显下降，差异有统计学意义（F=14.605，P<0.05）。见表1。
2.2 FAC对GCase蛋白表达的影响
析因设计方差分析显示，FAC和CBE两种因素不存在交互作用（P>0.05），因此进一步分析FAC、CBE主效应是否有统计学意义。100 μmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，FAC处理组蛋白表达较对照组明显上调，差异有统计学意义（F=4.934，P<0.05）;在100 μmol/L CBE处理SH-SY5Y细胞48 h后，CBE处理组与对照组比较蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（F=4.182，P<0.05）。见表1。
3 讨 论
PD的发病机制迄今未明，研究表明遗传因素、环境因素和老化因素均可参与PD中多巴胺能神经元的变性死亡过程[17-19]。据文献报道，在PD病人的黑质（SN）中铁的总量随疾病严重程度的增加而增加[20-23]，这些过量的不稳定性铁可通过Fenton反应催化产生具有高细胞毒性的羟自由基[14，22-25]，导致细胞死亡，从而造成疾病的发生。在GBA突变的PD病人的小脑、壳核、杏仁核、SN中GCase活性降低，其中以SN最明显。同时，在非GBA突变的散发性PD病人小脑和SN中GCase活性也明显下降[26-27]。在6-羟基多巴胺制备的PD大鼠模型中，检测到SN和纹状体的GCase活性下降[28]。
本实验用100 μmol/L FAC、100 μmol/L CBE处理SH-SY5Y多巴胺能神经元细胞系，研究铁对GCase活性及蛋白表达的影响。文献报道，溶酶体内的酶都是水解酶，而且一般最适pH值为5.0，所以都是酸性水解酶[29]。有研究表明，在铁负载的细胞中，溶酶体pH值从5.0增加到5.7，高铁破坏了细胞内溶酶体的酸性环境[30]。本研究结果显示，在FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，GCase的活性明显降低，提示细胞内的高铁环境破坏了溶酶体内的酸性环境，从而使GCase的活性降低。而GCase活性的降低可能代偿性地引起了GCase蛋白表达的增加。有关文献报道，神经元中加入野生型或者A53T突变的α-突触核蛋白在降低溶酶体中GCase活性的同时增加了GCase的蛋白表达，α-突触核蛋白可抑制GCase在细胞内的运输[31]。既往有研究表明，在SH-SY5Y细胞中，FAC可以诱导α-突触核蛋白表达升高[32-33]，CBE也可以诱导α-突触核蛋白表达升高[34-36]。本实验加入铁后细胞的GCase蛋白表达明显升高，推测可能是细胞内高铁环境诱导了α-突触核蛋白表达升高，升高的α-突触核蛋白抑制了内质网中GCase的合成，使其不能折叠成正常的构象而无法到达高尔基体加工成熟，未加工成熟的蛋白不具备酶的活性，因此GCase蛋白的表达升高，而酶活性降低。本實验中没有观察到FAC与GCase抑制剂两者的协同作用（析因设计方差分析显示，FAC、CBE两种因素之间无交互作用，因此说明FAC与CBE无协同作用）。 綜上所述，在高铁环境下，SH-SY5Y细胞内GCase的活性降低，蛋白的表达升高。本实验结果为进一步深入研究GCase在PD发病中的作用提供了一定的实验依据。
[参考文献]
[1] BLAUWENDRAAT C， REED X， KROHN L， et al. Genetic modifiers of risk and age at onset in GBA associated Parkinson’s disease and Lewy body dementia[J]. Brain，2020，143（1）：234-248.
[2] LEE A， GILBERT R M. Epidemiology of Parkinson disease[J]. Neurologic Clinics， 2016，34（4）：955-965.
[3] TOFFOLI M， SMITH L， SCHAPIRA A H. The biochemical basis of interactions between Glucocerebrosidase and alpha-synuclein in GBA1 mutation carriers[J]. Journal of Neuroche-mistry， 2020. doi：org/10.1111/jnc.14968.
[4] LUNDE K A， CHUNG J， DALEN I， et al. Association of glucocerebrosidase polymorphisms and mutations with dementia in incident Parkinson’s disease[J]. Alzheimer’s & Dementia： the Journal of the Alzheimer’s Association， 2018，14（10）：1293-1301.
[5] NALLS M A， DURAN R， LOPEZ G， et al. A multicenter study of glucocerebrosidase mutations in dementia with Lewy bodies[J]. JAMA Neurology， 2013，70（6）：727-735.
[6] DO J， MCKINNEY C， SHARMA P， et al. Glucocerebrosidase and its relevance to Parkinson disease[J]. Molecular Neurodegeneration， 2019，14（1）：36-52.
[7] HRUSKA K S， LAMARCA M E， SCOTT C R， et al. Gaucher disease： mutation and polymorphism spectrum in the glucocerebrosidase gene （GBA）[J]. Human Mutation， 2008，29（5）：567-583.
[8] LERCHE S， WURSTER I， ROEBEN B， et al. Parkinson’s disease： glucocerebrosidase 1 mutation severity is associated with CSF alpha-synuclein profiles[J]. Movement Disorders， 2020，35（3）：495-499.
[9] YANG S Y， GEGG M， CHAU D， et al. Glucocerebrosidase activity， cathepsin D and monomeric alpha-synuclein interactions in a stem cell derived neuronal model of a PD associated GBA1 mutation[J]. Neurobiol Dis， 2020，134：104620.
[10] BLANZ J， SAFTIG P. Parkinson’s disease： acid-glucocerebrosidase activity and alpha-synuclein clearance[J]. J Neurochem， 2016，139（Suppl 1）：198-215.
[11] XILOURI M， BREKK O R， STEFANIS L. Autophagy and alpha-synuclein： relevance to Parkinson’s disease and related synucleopathies[J]. Movement Disorders： Official Journal of the Movement Disorder Society， 2016，31（2）：178-192.
[12] HENDERSON M X， SEDOR S， MCGEARY I， et al. Glucocerebrosidase activity modulates neuronal susceptibility to pathological alpha-synuclein insult[J]. Neuron， 2020，105（5）：1-15.
[13] JIANG H， WANG J， ROGERS J， et al. Brain iron metabolism dysfunction in Parkinson’s disease[J]. Molecular Neurobiology， 2017，54（4）：3078-3101. [14] DE FARIAS C C， MAES M， BONIFACIO K L， et al. Parkinson’s disease is accompanied by intertwined alterations in iron metabolism and activated immune-inflammatory and oxidative stress pathways[J]. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets， 2017，16（4）：484-491.
[15] LAN A P， CHEN J， CHAI Z F， et al. The neurotoxicity of iron， copper and cobalt in Parkinson’s disease through ROS-mediated mechanisms[J]. Bio Metals， 2016，29（4）：665-678.
[16] YANG W S， SRIRAMARATNAM R， WELSCH M E， et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4[J]. Cell， 2014，156（1/2）：317-331.
[17] DENG H， WANG P， JANKOVIC J. The genetics of Parkinson disease[J]. Ageing Res Rev， 2018，42：72-85.
[18] TRANCHANT C. Introduction and classical environmental risk factors for Parkinson[J]. Revue Neurologique， 2019，175（10）：650-651.
[19] CHESNOKOVA A Y， EKIMOVA I V， PASTUKHOV Y F. Parkinson’s disease and aging[J]. Adv Gerontol， 2018，31（5）：668-678.
[20] BERGSLAND N， ZIVADINOV R， SCHWESER F， et al. Ventral posterior substantia nigra iron increases over 3 years in Parkinson’s disease[J]. Movement Disorders： Official Journal of the Movement Disorder Society， 2019，34（7）：1006-1013.
[21] YU Shuyang， CAO Chenjie， ZUO Lijun， et al. Clinical features and dysfunctions of iron metabolism in Parkinson disease patients with hyper echogenicity in substantia nigra： a cross-sectional study[J]. BMC Neurology， 2018，18（1）：9-17.
[22] WYPIJEWSKA A， GALAZKA-FRIEDMAN J， BAUMIN-GER E R， et al. Iron and reactive oxygen species activity in Parkinsonian substantia nigra[J]. Parkinsonism & Related Disorders， 2010，16（5）：329-333.
[23] BELAIDI A A， BUSH A I. Iron neurochemistry in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease： targets for therapeutics[J]. J Neurochem， 2016，139（Suppl 1）：179-197.
[24] GOZZELINO R， AROSIO P. Iron homeostasis in health and disease[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016，17（1）：130-144.
[25] SUN Y， PHAM A N， WAITE T D. The effect of vitamin C and iron on dopamine-mediated free radical generation： implications to Parkinson’s disease[J]. Dalton Transactions （Cambridge， England：2003）， 2018，47（12）：4059-4069.
[26] GEGG M E， BURKE D， HEALES S J， et al. Glucocerebrosidase deficiency in substantia nigra of parkinson disease brains[J]. Annals of Neurology， 2012，72（3）：455-463.
[27] MURPHY K E， GYSBERS A M， ABBOTT S K， et al. Reduced glucocerebrosidase is associated with increased alpha-synuclein in sporadic Parkinson’s disease[J]. Brain， 2014，137（Pt 3）：834-848. [28] MISHRA A， CHANDRAVANSHI L P， TRIGUN S K， et al. Ambroxol modulates 6-hydroxydopamine-induced temporal reduction in glucocerebrosidase （GCase） enzymatic activity and Parkinson’s disease symptoms[J]. Biochem Pharmacol， 2018，155：479-493.
[29] LUZIO J P， PRYOR P R， BRIGHT N A. Lysosomes： fusion and function[J]. Nature Reviews. Molecular Cell Biology， 2007，8（8）：622-632.
[30] KAO J K， WANG S C， HO L W， et al. Chronic iron overload results in impaired bacterial killing of THP-1 derived macrophage through the inhibition of lysosomal acidification[J]. PLoS One， 2016，11（5）：e0156713.
[31] MAZZULLI J R， XU Y H， SUN Y， et al. Gaucher disease glucocerebrosidase and alpha-synuclein form a bidirectional pathogenic loop in synucleinopathies[J]. Cell， 2011，146（1）：37-52.
[32] WANG R， WANG Y， QU L， et al. Iron-induced oxidative stress contributes to alpha-synuclein phosphorylation and up-regulation via polo-like kinase 2 and casein kinase 2[J]. Neurochem Int， 2019，125：127-135.
[33] GANGULY U， BANERJEE A， CHAKRABARTI S S， et al. Interaction of alpha-synuclein and Parkin in iron toxicity on SH-SY5Y cells： implications in the pathogenesis of Parkinson’s disease[J]. Biochemical Journal， 2020. doi：org/10.1042/BCJ20190676.
[34] ROCHA E M， SMITH G A， PARK E， et al. Sustained systemic glucocerebrosidase inhibition induces brain alpha-synuclein aggregation， microglia and complement C1q activation in mice[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2015，23（6）：550-564.
[35] XU YH， SUN Y， RAN H， et al. Accumulation and distribution of alpha-synuclein and ubiquitin in the CNS of Gaucher disease mouse models[J]. Mol Genet Metab， 2011，102（4）：436-447.
[36] MANNING-BOG A B， SCHULE B， LANGSTON J W. Alpha-synuclein-glucocerebrosidase interactions in pharmacological Gaucher models： a biological link between Gaucher disease and Parkinsonism[J]. Neurotoxicology， 2009，30（6）：1127-1132.
（本文編辑 马伟平）
[关键词] 铁;柠檬酸盐类;葡糖苷酰鞘氨醇酶;SH-SY5Y细胞
[中图分类号] R338.1;R345.62 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532（2020）02-0143-04
doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.058 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200407.0930.004.html;2020-04-07 14：57
[ABSTRACT] Objective To explore the effect of ferric ammonium citrate （FAC） on glucocerebrosidase （GCase） activity and expression in SH-SY5Y dopaminergic cells. Methods SH-SY5Y dopaminergic cells were treated with FAC and the GCase inhibitor conduritol B epoxide （CBE）， alone or in combination， for 48 h. Fluorometric assay was used to determine the GCase acti-vity. Western blotting was performed to determine the expression level of GCase. Results When FAC and CBE were used in combination to treat the SH-SY5Y cells， there was no interaction between them with regard to the effect on GCase activity and expression （P>0.05）. SH-SY5Y cells treated with FAC alone showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=8.191，4.934，P<0.05）; SH-SY5Y cells treated with CBE alone also showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=14.605，4.182，P<0.05）. Conclusion High level of iron can decrease the activity and increase the expression level of GCase in SH-SY5Y cells.
[KEY WORDS] iron; citrates; glucosylceramidase; SH-SY5Y cells
近年来遗传基因的发现为家族性和散发性帕金森病（PD）的发病机制提供新见解，有5%～10%的PD病例是遗传因素所致[1-2]。临床研究发现，PD病人中编码葡萄糖脑苷酯酶（GCase）的基因GBA突变率达20%，因此GBA突變是目前已知的PD和相关突触核蛋白病发展的最常见的遗传危险因素[3-5]。GCase是一种具有497个氨基酸的膜相关性蛋白，该蛋白在内质网中合成和经糖基化修饰后，被溶酶体膜整合蛋白-2转运至溶酶体中，发挥生物学功能[6]。GCase活性的降低可以导致葡萄糖神经酰胺的聚积，进而导致戈谢病的发生[7]。在PD中，GBA突变降低了GCase的活性，导致α-突触核蛋白聚集，而聚集的α-突触核蛋白又进一步促进了GCase活性的降低，形成恶性循环，造成多巴胺能神经元的死亡，因此GCase的活性与PD的发病进程密切相关[8-12]。铁是PD发病的重要因素之一[13]，铁可以诱导氧化应激和铁死亡等[14-16]，从而造成多巴胺能神经元的选择性损伤。然而，目前关于铁对GCase活性及其蛋白表达的影响尚未见报道。因此，本研究应用柠檬酸铁铵（FAC）制备SH-SY5Y多巴胺能细胞系的高铁模型，并使用GCase的不可逆竞争性抑制剂环己烯四醇环氧化物（CBE）作为对照药，探讨铁对GCase活性及其蛋白表达的影响。现将结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 实验材料
SH-SY5Y细胞系由中国科学院上海细胞库提供，DMEM高糖基础培养液、胎牛血清（FBS）购自以色列BI公司，4-甲基伞形酮-β-葡萄糖苷（4-MU-β-GLC）、CBE、FAC和GCase一抗购自美国Sigma公司，β-actin抗体、HRP-IgG标记的二抗购自北京博奥森公司，ECL发光液为Millipore公司产品，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 SH-SY5Y细胞的培养
实验前将实验器具高压灭菌。从液氮中取出冻存的SH-SY5Y细胞转移到37 ℃水浴中迅速（30 s内）解冻，充分摇匀后置于离心机中，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入完全培养液吹打均匀后接种到25 cm2细胞培养瓶中，光镜下观察细胞是否贴壁，然后置于培养箱中（37 ℃、含体积分数0.05 CO2）培养，每隔2 d传代1次。
1.3 实验分组及处理
将SH-SY5Y细胞分为对照组（A组）、FAC处理组（B组）、CBE处理组（C组）、FAC和CBE共处理组（D组）。将SH-SY5Y细胞以2×104/cm2的密度接种于6孔板中，每孔加入1.5 mL的细胞混悬液。当细胞达到50%～70%融合时，对照组加入新鲜无血清的培养液;FAC处理组加入100 μmol/L的FAC;CBE处理组则加入100 μmol/L的CBE;FAC和CBE共处理组先加入100 μmol/L的CBE预孵育30 min，再加入100 μmol/L的FAC。上述各组药物处理时间均为48 h。
1.4 GCase酶活性的测定
药物处理48 h后每孔加入100 μL的磷酸盐缓冲液，于冰上静置30 min后用刮板刮下细胞并在细胞破碎仪中破碎，破碎强度为30%;在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min;取2.5 μL的上清，加入5 mmol/L的4-MU-β-GLC 12.5 μL，37 ℃孵育30 min后，加入1 mol/L的甘氨酸缓冲液（pH值=10）终止反应。在酶标仪上设定激发光波长EX=360 nm、发射光波长Em=460 nm，检测产物4-甲基伞形酮的含量，以相对荧光单位（RFU）表示，并应用BCA蛋白定量试剂盒检测提取样品的蛋白浓度（RFU/μg总蛋白）。
1.5 免疫印迹法检测GCase蛋白表达
药物处理48 h后提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测提取蛋白的浓度，以每孔总蛋白量为20 μg计算蛋白上样量，加入Loading Buffer，95 ℃煮5 min。经120 g/L的SDS-PAGE凝胶电泳后湿转到0.45 μm 的PVDF膜上，室温下用100 g/L的脱脂奶粉溶液封闭2 h，再分别加入GCase（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗于4 ℃摇床过夜。第2天用山羊抗兔的HRP-IgG（1∶10 000）孵育1 h后以TBST溶液洗3次，每次10 min，ECL发光液显影后用Image J统计结果。
1.6 统计学处理
应用SPSS 22.0软件进行统计分析，实验结果以±s表示，针对FAC和CBE两种处理因素，采用析因设计的方差分析进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 FAC对GCase活性的影响
析因设计方差分析显示，FAC和CBE这两种因素对GCase活性的影响不存在交互作用（P>0.05），因此进一步分析FAC、CBE主效应的结果是否具有统计学意义。100 μmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，FAC处理组酶活性较对照组有明显的下降，差异有统计学意义（F=8.191，P<0.05）;在CBE处理SH-SY5Y细胞48 h后，CBE处理组酶活性也较对照组明显下降，差异有统计学意义（F=14.605，P<0.05）。见表1。
2.2 FAC对GCase蛋白表达的影响
析因设计方差分析显示，FAC和CBE两种因素不存在交互作用（P>0.05），因此进一步分析FAC、CBE主效应是否有统计学意义。100 μmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，FAC处理组蛋白表达较对照组明显上调，差异有统计学意义（F=4.934，P<0.05）;在100 μmol/L CBE处理SH-SY5Y细胞48 h后，CBE处理组与对照组比较蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（F=4.182，P<0.05）。见表1。
3 讨 论
PD的发病机制迄今未明，研究表明遗传因素、环境因素和老化因素均可参与PD中多巴胺能神经元的变性死亡过程[17-19]。据文献报道，在PD病人的黑质（SN）中铁的总量随疾病严重程度的增加而增加[20-23]，这些过量的不稳定性铁可通过Fenton反应催化产生具有高细胞毒性的羟自由基[14，22-25]，导致细胞死亡，从而造成疾病的发生。在GBA突变的PD病人的小脑、壳核、杏仁核、SN中GCase活性降低，其中以SN最明显。同时，在非GBA突变的散发性PD病人小脑和SN中GCase活性也明显下降[26-27]。在6-羟基多巴胺制备的PD大鼠模型中，检测到SN和纹状体的GCase活性下降[28]。
本实验用100 μmol/L FAC、100 μmol/L CBE处理SH-SY5Y多巴胺能神经元细胞系，研究铁对GCase活性及蛋白表达的影响。文献报道，溶酶体内的酶都是水解酶，而且一般最适pH值为5.0，所以都是酸性水解酶[29]。有研究表明，在铁负载的细胞中，溶酶体pH值从5.0增加到5.7，高铁破坏了细胞内溶酶体的酸性环境[30]。本研究结果显示，在FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，GCase的活性明显降低，提示细胞内的高铁环境破坏了溶酶体内的酸性环境，从而使GCase的活性降低。而GCase活性的降低可能代偿性地引起了GCase蛋白表达的增加。有关文献报道，神经元中加入野生型或者A53T突变的α-突触核蛋白在降低溶酶体中GCase活性的同时增加了GCase的蛋白表达，α-突触核蛋白可抑制GCase在细胞内的运输[31]。既往有研究表明，在SH-SY5Y细胞中，FAC可以诱导α-突触核蛋白表达升高[32-33]，CBE也可以诱导α-突触核蛋白表达升高[34-36]。本实验加入铁后细胞的GCase蛋白表达明显升高，推测可能是细胞内高铁环境诱导了α-突触核蛋白表达升高，升高的α-突触核蛋白抑制了内质网中GCase的合成，使其不能折叠成正常的构象而无法到达高尔基体加工成熟，未加工成熟的蛋白不具备酶的活性，因此GCase蛋白的表达升高，而酶活性降低。本實验中没有观察到FAC与GCase抑制剂两者的协同作用（析因设计方差分析显示，FAC、CBE两种因素之间无交互作用，因此说明FAC与CBE无协同作用）。 綜上所述，在高铁环境下，SH-SY5Y细胞内GCase的活性降低，蛋白的表达升高。本实验结果为进一步深入研究GCase在PD发病中的作用提供了一定的实验依据。
[参考文献]
[1] BLAUWENDRAAT C， REED X， KROHN L， et al. Genetic modifiers of risk and age at onset in GBA associated Parkinson’s disease and Lewy body dementia[J]. Brain，2020，143（1）：234-248.
[2] LEE A， GILBERT R M. Epidemiology of Parkinson disease[J]. Neurologic Clinics， 2016，34（4）：955-965.
[3] TOFFOLI M， SMITH L， SCHAPIRA A H. The biochemical basis of interactions between Glucocerebrosidase and alpha-synuclein in GBA1 mutation carriers[J]. Journal of Neuroche-mistry， 2020. doi：org/10.1111/jnc.14968.
[4] LUNDE K A， CHUNG J， DALEN I， et al. Association of glucocerebrosidase polymorphisms and mutations with dementia in incident Parkinson’s disease[J]. Alzheimer’s & Dementia： the Journal of the Alzheimer’s Association， 2018，14（10）：1293-1301.
[5] NALLS M A， DURAN R， LOPEZ G， et al. A multicenter study of glucocerebrosidase mutations in dementia with Lewy bodies[J]. JAMA Neurology， 2013，70（6）：727-735.
[6] DO J， MCKINNEY C， SHARMA P， et al. Glucocerebrosidase and its relevance to Parkinson disease[J]. Molecular Neurodegeneration， 2019，14（1）：36-52.
[7] HRUSKA K S， LAMARCA M E， SCOTT C R， et al. Gaucher disease： mutation and polymorphism spectrum in the glucocerebrosidase gene （GBA）[J]. Human Mutation， 2008，29（5）：567-583.
[8] LERCHE S， WURSTER I， ROEBEN B， et al. Parkinson’s disease： glucocerebrosidase 1 mutation severity is associated with CSF alpha-synuclein profiles[J]. Movement Disorders， 2020，35（3）：495-499.
[9] YANG S Y， GEGG M， CHAU D， et al. Glucocerebrosidase activity， cathepsin D and monomeric alpha-synuclein interactions in a stem cell derived neuronal model of a PD associated GBA1 mutation[J]. Neurobiol Dis， 2020，134：104620.
[10] BLANZ J， SAFTIG P. Parkinson’s disease： acid-glucocerebrosidase activity and alpha-synuclein clearance[J]. J Neurochem， 2016，139（Suppl 1）：198-215.
[11] XILOURI M， BREKK O R， STEFANIS L. Autophagy and alpha-synuclein： relevance to Parkinson’s disease and related synucleopathies[J]. Movement Disorders： Official Journal of the Movement Disorder Society， 2016，31（2）：178-192.
[12] HENDERSON M X， SEDOR S， MCGEARY I， et al. Glucocerebrosidase activity modulates neuronal susceptibility to pathological alpha-synuclein insult[J]. Neuron， 2020，105（5）：1-15.
[13] JIANG H， WANG J， ROGERS J， et al. Brain iron metabolism dysfunction in Parkinson’s disease[J]. Molecular Neurobiology， 2017，54（4）：3078-3101. [14] DE FARIAS C C， MAES M， BONIFACIO K L， et al. Parkinson’s disease is accompanied by intertwined alterations in iron metabolism and activated immune-inflammatory and oxidative stress pathways[J]. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets， 2017，16（4）：484-491.
[15] LAN A P， CHEN J， CHAI Z F， et al. The neurotoxicity of iron， copper and cobalt in Parkinson’s disease through ROS-mediated mechanisms[J]. Bio Metals， 2016，29（4）：665-678.
[16] YANG W S， SRIRAMARATNAM R， WELSCH M E， et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4[J]. Cell， 2014，156（1/2）：317-331.
[17] DENG H， WANG P， JANKOVIC J. The genetics of Parkinson disease[J]. Ageing Res Rev， 2018，42：72-85.
[18] TRANCHANT C. Introduction and classical environmental risk factors for Parkinson[J]. Revue Neurologique， 2019，175（10）：650-651.
[19] CHESNOKOVA A Y， EKIMOVA I V， PASTUKHOV Y F. Parkinson’s disease and aging[J]. Adv Gerontol， 2018，31（5）：668-678.
[20] BERGSLAND N， ZIVADINOV R， SCHWESER F， et al. Ventral posterior substantia nigra iron increases over 3 years in Parkinson’s disease[J]. Movement Disorders： Official Journal of the Movement Disorder Society， 2019，34（7）：1006-1013.
[21] YU Shuyang， CAO Chenjie， ZUO Lijun， et al. Clinical features and dysfunctions of iron metabolism in Parkinson disease patients with hyper echogenicity in substantia nigra： a cross-sectional study[J]. BMC Neurology， 2018，18（1）：9-17.
[22] WYPIJEWSKA A， GALAZKA-FRIEDMAN J， BAUMIN-GER E R， et al. Iron and reactive oxygen species activity in Parkinsonian substantia nigra[J]. Parkinsonism & Related Disorders， 2010，16（5）：329-333.
[23] BELAIDI A A， BUSH A I. Iron neurochemistry in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease： targets for therapeutics[J]. J Neurochem， 2016，139（Suppl 1）：179-197.
[24] GOZZELINO R， AROSIO P. Iron homeostasis in health and disease[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016，17（1）：130-144.
[25] SUN Y， PHAM A N， WAITE T D. The effect of vitamin C and iron on dopamine-mediated free radical generation： implications to Parkinson’s disease[J]. Dalton Transactions （Cambridge， England：2003）， 2018，47（12）：4059-4069.
[26] GEGG M E， BURKE D， HEALES S J， et al. Glucocerebrosidase deficiency in substantia nigra of parkinson disease brains[J]. Annals of Neurology， 2012，72（3）：455-463.
[27] MURPHY K E， GYSBERS A M， ABBOTT S K， et al. Reduced glucocerebrosidase is associated with increased alpha-synuclein in sporadic Parkinson’s disease[J]. Brain， 2014，137（Pt 3）：834-848. [28] MISHRA A， CHANDRAVANSHI L P， TRIGUN S K， et al. Ambroxol modulates 6-hydroxydopamine-induced temporal reduction in glucocerebrosidase （GCase） enzymatic activity and Parkinson’s disease symptoms[J]. Biochem Pharmacol， 2018，155：479-493.
[29] LUZIO J P， PRYOR P R， BRIGHT N A. Lysosomes： fusion and function[J]. Nature Reviews. Molecular Cell Biology， 2007，8（8）：622-632.
[30] KAO J K， WANG S C， HO L W， et al. Chronic iron overload results in impaired bacterial killing of THP-1 derived macrophage through the inhibition of lysosomal acidification[J]. PLoS One， 2016，11（5）：e0156713.
[31] MAZZULLI J R， XU Y H， SUN Y， et al. Gaucher disease glucocerebrosidase and alpha-synuclein form a bidirectional pathogenic loop in synucleinopathies[J]. Cell， 2011，146（1）：37-52.
[32] WANG R， WANG Y， QU L， et al. Iron-induced oxidative stress contributes to alpha-synuclein phosphorylation and up-regulation via polo-like kinase 2 and casein kinase 2[J]. Neurochem Int， 2019，125：127-135.
[33] GANGULY U， BANERJEE A， CHAKRABARTI S S， et al. Interaction of alpha-synuclein and Parkin in iron toxicity on SH-SY5Y cells： implications in the pathogenesis of Parkinson’s disease[J]. Biochemical Journal， 2020. doi：org/10.1042/BCJ20190676.
[34] ROCHA E M， SMITH G A， PARK E， et al. Sustained systemic glucocerebrosidase inhibition induces brain alpha-synuclein aggregation， microglia and complement C1q activation in mice[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2015，23（6）：550-564.
[35] XU YH， SUN Y， RAN H， et al. Accumulation and distribution of alpha-synuclein and ubiquitin in the CNS of Gaucher disease mouse models[J]. Mol Genet Metab， 2011，102（4）：436-447.
[36] MANNING-BOG A B， SCHULE B， LANGSTON J W. Alpha-synuclein-glucocerebrosidase interactions in pharmacological Gaucher models： a biological link between Gaucher disease and Parkinsonism[J]. Neurotoxicology， 2009，30（6）：1127-1132.
（本文編辑 马伟平）