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摘要[目的]建立同时测定蜂蜜中磺胺类和氯霉素类的超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS）的新方法。[方法]试验以0.2%的甲酸乙腈作为提取剂，通过一种新型的小柱（Oasis PRiME HLB柱）净化处理，流动相定容过膜后上机待测，可以同时提取出蜂蜜中的磺胺类和氯霉素类。[结果]氯霉素在 0.1 ～ 10.0 ng/mL 范围内有良好的线性关系，相关系数大于 0.991；磺胺類在0.5～50.0 ng/mL范围内线性关系良好。氯霉素样品最低检出限为 0.1 μg/kg，磺胺类检出限为0.5 μg/kg，回收率在 82.50%～101.20%，相对标准偏差为 32%～4.0%。[结论]该方法快速、准确、灵敏度高，适用于蜂蜜中氯霉素类和磺胺类的检测。
关键词超高效液相色谱串联质谱；磺胺类；氯霉素类；蜂蜜
中图分类号S896.1；TS207.3文献标识码A文章编号0517-6611（2016）31-0034-03
Abstract[Objective] To establish a new method UPLCMS for the determination of sulfanilamide grous and chloramphenicols in honey. [Method] With 0.2% formic acid acetonitrile as the extraction agent， through purification treatment by a new column （Oasis PRiME HLB）， sulfanilamide grous and chloramphenicols can be extracted simultaneously. [Result] Chloramphenicol had a good linear relationship in the range of 0.1-10.0 ng/mL， and the correlation coefficient was greater than 0.991； sulfanilamide grous had a good linear relationship in the range of 0.5-50.0 ng/mL. The lowest detection limit of chloramphenicol was 0.1 g/kg， detection limit of sulfanilamide grous was 0.5 μg/kg， recovery was 82.5%-101.2%， relative standard deviation was 3.2%-4.0%. [Conclusion] The method is rapid， accurate and sensitive， and it is suitable for the detection of chloramphenicol and sulfanilamide grous.
Key wordsUHPLCMS； Sulfanilamide grous； Chloramphenicols； Honey
兽药氯霉素类是一种抗生素，主要用于伤寒、副伤寒和其他沙门菌等的防治。蜂农有时会在生病的蜜蜂中喷洒氯霉素类兽药以缩短养蜂周期和让病蜂可以持续工作，因此在蜂蜜中会有蓄积。氯霉素会对人体的造血系统产生较大的影响，儿童使用会导致循环衰竭、贫血甚至再生障碍性贫血。近年来，蜂蜜中氯霉素的检测方法主要有高效液相色谱法[1]、毛细管电泳法[2]、酶联免疫法[3]、气相色谱-质谱联用法[4]和液相色谱-质谱联用法[5]等。
磺胺类药物是一种人工合成的抗菌药物，具有预防和抑制细菌感染性疾病的作用，同时也是动物的生长促进剂，这些药物进入蜂蜜体内会在其体内蓄积。目前蜂蜜中磺胺类的检测方法主要有高效液相色谱法[6]、免疫胶体金法[7]、ELISA检测试剂盒法[8]、薄层色谱法[9]以及高效液相色谱质谱联用法[10]等。
蜂蜜中同时处理兽药残留氯霉素类和磺胺类的方法极少有报道，因此建立一种同时处理这2类药物残留的方法非常有必要。笔者将蜂蜜样品经酸化乙腈提取，OasisPRiME HLB固相萃取小柱通过式净化处理，经超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS）检测，对样品前处理过程和液相、质谱条件进行了优化，建立了蜂蜜中多兽药残留同时检测的方法。
1材料与方法
1.1材料Agilent 1260-6460超高效液相色谱-质谱联用仪；超纯水机，北京普析，固相萃取仪、氮吹浓缩仪、横式振荡器、涡旋混合器，德国 IKA。标准品：氯霉素（chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺多辛、磺胺二甲基哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹口恶啉，所有标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。
1.2方法
1.2.1标准溶液的配制。精密称取适量的氯霉素，以甲醇作为溶剂配制成1.0 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃冰箱中避光保存。将上述标准储备液用甲醇逐级稀释，配制成10 μg/kg的标准使用液。分别精密称取适量的16种磺胺标准品，以甲醇作为溶剂配制成1.0 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃冰箱中避光保存。将上述标准储备液分别逐级稀释，最终配制成100 μg/kg的磺胺混合标准使用液。
1.2.2样品前处理。准确称取混合均匀的蜂蜜5.0 g（精确至0.001 g），置于50 mL的离心管中，加入5 mL 水充分溶解，准确加入15 mL 0.2%甲酸乙腈，涡旋提取 30 s，于6 000 r/min离心5 min。将上清液经过无水硫酸钠于离心管中，残渣继续用15 mL 0.2%甲酸乙腈重复提取1次，合并上清液。取上清液准备过 Oasis PRiME HLB固相萃取柱。取OasisPRiME HLB固相萃取小柱，3 mL 80%乙腈清洗活化。将上清液上HLB小柱，保持每秒1滴的流速，收集全部流出液，氮气下吹干，1 mL流动相定容，过微孔滤膜，上UPLCMS测试。 1.2.3UPLC 色谱条件。Agilent超高效液相色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 （1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.4 mL/min。因为氯霉素为负离子模式，而磺胺为正离子模式。氯霉素类梯度洗脱程序见表1，磺胺类梯度洗脱程序见表2。
2结果与分析
2.1前处理方法的选择该试验中使用不同浓度甲酸酸化的乙腈溶液，按不同比例加入蜂蜜样品，提取目标化合物。试验中尝试了0.2%甲酸和10%甲酸2种不同比例的有机酸，同时比较了乙腈和样品比例分别为3∶1和4∶1提取净化的效果。结果表明，当采用10%甲酸乙腈和样品比例为4∶1时效果最好，但是10%甲酸的添加对磺胺类等碱性化合物回收率影响较大，原因可能是酸性条件下碱性化合物的离子化趋势增大，在高比例有机相中溶解性减弱。试验最终选用02%甲酸乙腈，4∶1比例加入样品提取。具体数据见图1。
2萃取柱选择根据试验分别对MCX柱、SCX柱、HLB柱以及OasisPRiME HLB固相萃取柱进行比较，结果表明，OasisPRiME HLB固相萃取柱不仅可以同时洗脱出磺胺类和氯霉素类，而且该柱本身不需要活化，节省了时间，同时各种药物残留回收率好，适合蜂蜜中磺胺和氯霉素的同時分析。
2.3标准工作曲线与检出限根据试验方法测定氯霉素类在0.1～10.0 ng/mL范围内线性关系良好，而磺胺类在0.5～50.0 ng/mL范围内线性关系良好。其回归方程见表5。
结论与讨论
该试验利用0.2%的甲酸乙腈作为提取剂从蜂蜜中同时提取药物残留磺胺类和氯霉素类，将提取后的液体经过一种高效的分离柱Oasis PRiME HLB，该分离柱与以往的SPE柱不同，它是一种通过式的固相萃取方式，将蛋白质、脂肪、磷脂等杂质吸附，将需要提取的物质通过。经过氮吹浓缩、流动相溶解、过膜上机可以同时测定氯霉素类和磺胺类的残留量。结果表明，在0.1～10.0 μg/L的添加浓度范围内，磺胺、氯霉素回收率在8250%～10120%，精密度RSD<10%（n=5）。该方法简单快捷，检出限低，回收率高，重现性好，可以同时测定氯霉素类和磺胺类药物残留，可节省时间，适用于蜂蜜中兽药残留的检测需求。
安徽农业科学2016年参考文献
[1] 潘莹宇，许茜，康学军，等.高效液相色谱 - 荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量[J].色谱，2005，23（6）：577-580.
[2] 陈天豹，邓文汉，卢菀华，等.毛细管电泳法检测蜂蜜中残留的抗生素[J].色谱，2001，19（1）：91-93.
[3] 彭运平，齐维，唐海波，等.应用酶联免疫法检测鱼肉、蜂蜜中氯霉素的残留量[J].现代食品科技，2010，26（12）：1415-1417.
[4] 吴晓波，薛健，彭峥国.GCMS/MS在中药农药多残留检测中的应用[J].江苏农业科学，2011，39（2）：433-434.
关键词超高效液相色谱串联质谱；磺胺类；氯霉素类；蜂蜜
中图分类号S896.1；TS207.3文献标识码A文章编号0517-6611（2016）31-0034-03
Abstract[Objective] To establish a new method UPLCMS for the determination of sulfanilamide grous and chloramphenicols in honey. [Method] With 0.2% formic acid acetonitrile as the extraction agent， through purification treatment by a new column （Oasis PRiME HLB）， sulfanilamide grous and chloramphenicols can be extracted simultaneously. [Result] Chloramphenicol had a good linear relationship in the range of 0.1-10.0 ng/mL， and the correlation coefficient was greater than 0.991； sulfanilamide grous had a good linear relationship in the range of 0.5-50.0 ng/mL. The lowest detection limit of chloramphenicol was 0.1 g/kg， detection limit of sulfanilamide grous was 0.5 μg/kg， recovery was 82.5%-101.2%， relative standard deviation was 3.2%-4.0%. [Conclusion] The method is rapid， accurate and sensitive， and it is suitable for the detection of chloramphenicol and sulfanilamide grous.
Key wordsUHPLCMS； Sulfanilamide grous； Chloramphenicols； Honey
兽药氯霉素类是一种抗生素，主要用于伤寒、副伤寒和其他沙门菌等的防治。蜂农有时会在生病的蜜蜂中喷洒氯霉素类兽药以缩短养蜂周期和让病蜂可以持续工作，因此在蜂蜜中会有蓄积。氯霉素会对人体的造血系统产生较大的影响，儿童使用会导致循环衰竭、贫血甚至再生障碍性贫血。近年来，蜂蜜中氯霉素的检测方法主要有高效液相色谱法[1]、毛细管电泳法[2]、酶联免疫法[3]、气相色谱-质谱联用法[4]和液相色谱-质谱联用法[5]等。
磺胺类药物是一种人工合成的抗菌药物，具有预防和抑制细菌感染性疾病的作用，同时也是动物的生长促进剂，这些药物进入蜂蜜体内会在其体内蓄积。目前蜂蜜中磺胺类的检测方法主要有高效液相色谱法[6]、免疫胶体金法[7]、ELISA检测试剂盒法[8]、薄层色谱法[9]以及高效液相色谱质谱联用法[10]等。
蜂蜜中同时处理兽药残留氯霉素类和磺胺类的方法极少有报道，因此建立一种同时处理这2类药物残留的方法非常有必要。笔者将蜂蜜样品经酸化乙腈提取，OasisPRiME HLB固相萃取小柱通过式净化处理，经超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS）检测，对样品前处理过程和液相、质谱条件进行了优化，建立了蜂蜜中多兽药残留同时检测的方法。
1材料与方法
1.1材料Agilent 1260-6460超高效液相色谱-质谱联用仪；超纯水机，北京普析，固相萃取仪、氮吹浓缩仪、横式振荡器、涡旋混合器，德国 IKA。标准品：氯霉素（chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺多辛、磺胺二甲基哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹口恶啉，所有标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。
1.2方法
1.2.1标准溶液的配制。精密称取适量的氯霉素，以甲醇作为溶剂配制成1.0 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃冰箱中避光保存。将上述标准储备液用甲醇逐级稀释，配制成10 μg/kg的标准使用液。分别精密称取适量的16种磺胺标准品，以甲醇作为溶剂配制成1.0 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃冰箱中避光保存。将上述标准储备液分别逐级稀释，最终配制成100 μg/kg的磺胺混合标准使用液。
1.2.2样品前处理。准确称取混合均匀的蜂蜜5.0 g（精确至0.001 g），置于50 mL的离心管中，加入5 mL 水充分溶解，准确加入15 mL 0.2%甲酸乙腈，涡旋提取 30 s，于6 000 r/min离心5 min。将上清液经过无水硫酸钠于离心管中，残渣继续用15 mL 0.2%甲酸乙腈重复提取1次，合并上清液。取上清液准备过 Oasis PRiME HLB固相萃取柱。取OasisPRiME HLB固相萃取小柱，3 mL 80%乙腈清洗活化。将上清液上HLB小柱，保持每秒1滴的流速，收集全部流出液，氮气下吹干，1 mL流动相定容，过微孔滤膜，上UPLCMS测试。 1.2.3UPLC 色谱条件。Agilent超高效液相色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 （1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.4 mL/min。因为氯霉素为负离子模式，而磺胺为正离子模式。氯霉素类梯度洗脱程序见表1，磺胺类梯度洗脱程序见表2。
2结果与分析
2.1前处理方法的选择该试验中使用不同浓度甲酸酸化的乙腈溶液，按不同比例加入蜂蜜样品，提取目标化合物。试验中尝试了0.2%甲酸和10%甲酸2种不同比例的有机酸，同时比较了乙腈和样品比例分别为3∶1和4∶1提取净化的效果。结果表明，当采用10%甲酸乙腈和样品比例为4∶1时效果最好，但是10%甲酸的添加对磺胺类等碱性化合物回收率影响较大，原因可能是酸性条件下碱性化合物的离子化趋势增大，在高比例有机相中溶解性减弱。试验最终选用02%甲酸乙腈，4∶1比例加入样品提取。具体数据见图1。
2萃取柱选择根据试验分别对MCX柱、SCX柱、HLB柱以及OasisPRiME HLB固相萃取柱进行比较，结果表明，OasisPRiME HLB固相萃取柱不仅可以同时洗脱出磺胺类和氯霉素类，而且该柱本身不需要活化，节省了时间，同时各种药物残留回收率好，适合蜂蜜中磺胺和氯霉素的同時分析。
2.3标准工作曲线与检出限根据试验方法测定氯霉素类在0.1～10.0 ng/mL范围内线性关系良好，而磺胺类在0.5～50.0 ng/mL范围内线性关系良好。其回归方程见表5。
结论与讨论
该试验利用0.2%的甲酸乙腈作为提取剂从蜂蜜中同时提取药物残留磺胺类和氯霉素类，将提取后的液体经过一种高效的分离柱Oasis PRiME HLB，该分离柱与以往的SPE柱不同，它是一种通过式的固相萃取方式，将蛋白质、脂肪、磷脂等杂质吸附，将需要提取的物质通过。经过氮吹浓缩、流动相溶解、过膜上机可以同时测定氯霉素类和磺胺类的残留量。结果表明，在0.1～10.0 μg/L的添加浓度范围内，磺胺、氯霉素回收率在8250%～10120%，精密度RSD<10%（n=5）。该方法简单快捷，检出限低，回收率高，重现性好，可以同时测定氯霉素类和磺胺类药物残留，可节省时间，适用于蜂蜜中兽药残留的检测需求。
安徽农业科学2016年参考文献
[1] 潘莹宇，许茜，康学军，等.高效液相色谱 - 荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量[J].色谱，2005，23（6）：577-580.
[2] 陈天豹，邓文汉，卢菀华，等.毛细管电泳法检测蜂蜜中残留的抗生素[J].色谱，2001，19（1）：91-93.
[3] 彭运平，齐维，唐海波，等.应用酶联免疫法检测鱼肉、蜂蜜中氯霉素的残留量[J].现代食品科技，2010，26（12）：1415-1417.
[4] 吴晓波，薛健，彭峥国.GCMS/MS在中药农药多残留检测中的应用[J].江苏农业科学，2011，39（2）：433-434.