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摘要 [目的]建立甲基硫菌灵和多菌灵在荔枝果肉中的高效液相色谱（HPLC）检测分析方法。[方法]样品采用甲酸-乙腈作为提取溶剂、乙二胺N-丙基硅烷吸附剂（PSA）进行净化，高效液相色谱检测分析荔枝果肉基质中的甲基硫菌灵和多菌灵残留量。[结果]甲基硫菌灵和多菌灵在为0.01～1.00 mg/kg添加水平下的添加回收率分别为78.9%～97.6%、79.8%～94.6%，相对标准偏差分别为2.08%～3.95%、3.04%～5.27%;最低检出量均为0.1 ng，最小检出浓度均为0.01 mg/kg。[结论]该前处理方法简便、有机溶剂用量少，准确度、精密度等均符合农药残留检测分析要求。
關键词 甲基硫菌灵;多菌灵;荔枝果肉;高效液相色谱法;代谢物;残留量
中图分类号 TS207.5+3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）35-0174-03
甲基硫菌灵（thiophanatemethyl）是具有高效低毒的广谱性内吸杀菌剂，具有保护和治疗作用，广泛用于粮食、棉花、蔬菜、果树等多种作物上的病害防治，甲基硫菌灵在作物和土壤中使用后易转化为多菌灵[1-3]，我国规定甲基硫菌灵残留定义为甲基硫菌灵和多菌灵之和，以多菌灵表示。多菌灵（carbendazim）属于广谱低毒苯并咪唑类杀菌剂，广泛用于大田作物、蔬菜、果树和经济作物的子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门的许多病害防治。GB 2763—2016（食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量）中甲基硫菌灵仅在苹果、梨、葡萄和西瓜等4种水果上制定了最大残留限量标准，暂无荔枝。因此，通过建立甲基硫菌灵和多菌灵在荔枝果肉中的分析方法，为其后续在作物上的残留量测定提供方法指导。
目前，有关甲基硫菌灵和多菌灵的分析方法报道主要有采用HPLC和HPLC-MS方法测定其在番茄、柑橘、黄瓜、芝麻等作物上的残留[4-15]，而荔枝果肉中的分析方法鲜见报道。笔者通过高效液相色谱技术建立了甲基硫菌灵和多菌灵在荔枝果肉中的残留量分析方法，为监测市场荔枝产品中2种环境污染物提供了分析方法参考。
1 材料与方法
1.1 仪器
岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）;匀浆机（IKA-T18型，德国制造）;离心机（GTR-22-1型高速冷冻离心机，北京时代北利离心机有限公司）;氮吹仪（OA-SYS，美国Organomation公司）。
1.2 试剂
甲基硫菌灵和多菌灵标准品，纯度分别为99.5%和98.6%，均购自美国Chem Service公司;甲醇、乙腈（色谱纯）;甲酸（色谱纯，美国Fluka公司）;无水MgSO4和NaCl（国药集团化学试剂有限公司）;乙二胺N-丙基硅烷吸附剂（PSA）（上海安谱实验科技股份有限公司）。
1.3 样品前处理
1.3.1 样品预处理。
1.3.1.1 荔枝样本采集。随机在试验小区荔枝树的不同方向及上、中、下、里、外等不同部位用剪刀采集不少于2 kg生长正常、无病害、未喷施过甲基硫菌灵和多菌灵的荔枝空白个体，装入样本袋中，贴好标签，尽快送往实验室。
1.3.1.2 荔枝果肉样品。所有器具冲洗后，取田间荔枝残留样本剥去荔枝皮，取出果肉和果核，果核弃去，将果肉切碎混匀，用四分法缩分，分取250 g 样品2份，装入样品容器中，贴好标签，并贮存在-20 ℃低温冰箱中待用。
1.3.2 添加样品及检测。
称取20.0 g已制备好荔枝果肉样品于100 mL离心管中，分别从1、10、100 mg/L甲基硫菌灵和多菌灵混合标准溶液中吸取0.2 mL添加到已称好的果肉样品中，静置1 h，再加入40 mL 0.1%甲酸-乙腈提取，匀浆2 min，加入7 g NaCl，涡旋1 min，5 000 r/min离心5 min。取上层乙腈提取液20 mL（相当于10 g样品量）浓缩约50 μL，用乙腈定容至2 mL，待净化。
将2 mL乙腈提取液转移至加有150 mg无水MgSO4、50 mg PSA的离心管中，用手剧烈振荡，涡旋10 s，10 000 r/min离心2 min。取上清液过0.22 μm有机滤膜，待HPLC测定。
1.4 色谱条件
岛津LC-20A配二极管阵列紫外检测器，色谱柱为Wondasil C18-WR（250 mm×4.6 mm×5 μm），流动相为水/甲醇/乙腈/0.1%甲酸水溶液（体积比36.4∶3.0∶60.0∶0.6），流速为0.5 mL/min，波长272 nm，进样量为30 μL。
1.5 标准曲线制作
准确称取甲基硫菌灵和多菌灵标准品，用乙腈配成1 000 mg/L的标准溶液，采用系列稀释法稀释至所需的质量浓度0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L，以峰面积（y）对进样量（x）做图，建立甲基硫菌灵和多菌灵的标准曲线方程。
1.6 添加回收率测定
取荔枝果肉空白样品20.0 g，添加水平为0.01～1.00 mg/kg，重复5次，按照上述提取净化方法处理之后，用液相色谱仪器进行测定，计算添加回收率。
2 结果与分析
2.1 仪器条件优化
2.1.1 流动相选择。
比较了Wondasil C18-WR、Thermo batabasic-18和依利特Hypersil ODS2等3种反相色谱柱对甲基硫菌灵和多菌灵2种化合物峰型、保留时间、响应强度等的影响。结果显示，采用Thermo batabasic-18时，甲基硫菌灵色谱峰有分叉，不对称，且不能回归基线，多菌灵基线漂移;依利特Hypersil ODS2色谱柱，甲基硫菌灵峰型不对称，基线漂移，多菌灵响应值减弱;应用Wondasil C18-WR色谱柱，2种目标农药的峰型对称，基线稳定，响应值高，能达到完全分离。 2.1.2 流速选择。
采用Wondasil C18-WR色谱柱，分别设置流速为0.4和0.5 mL/min，比较甲基硫菌灵和多菌灵的保留时间、峰型等。结果发现，当流速为0.4 mL/min，甲基硫菌灵的峰型不对称，灵敏度降低;流速为0.5 mL/min，峰型对称，基线平稳，分离度较好，响应强度高。
2.2 提取剂选择
分别比较了丙酮和乙腈2种常用有机溶剂对荔枝果肉基质中甲基硫菌灵和多菌灵的提取效率，结果显示，当丙酮作为提取溶剂时，可将基质中的糖类等杂质与目标农药一并提取，样品黏稠，加大了净化难度，并可导致色谱柱、检测器的污染，此外，丙酮易溶于水，不易达到明显分层效果，不利于后续净化;乙腈中加入少量甲酸作为提取溶剂，可显著提高甲基硫菌灵和多菌灵在基质中的提取效率，且提取液较清澈，两相界面分层效果明显，适于作为荔枝果肉基质的提取剂。
2.3 净化条件优化
无水MgSO4主要作用是用于除去样品中的水分，确保目标分析物易被有机溶剂完全提取;PSA作为弱阴离子交换填料，能够有效去除基质中糖类、脂肪酸等物质。荔枝果肉中含有大量糖分、维生素、氨基酸等物质，采用PSA能够有效去除杂质干扰，确保目标分析物峰型对称、无拖尾。
2.4 线性范围
以甲基硫菌灵和多菌灵的浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标，在浓度为0.01～2.00 mg/L范围内2种目标农药的浓度与其响应峰面积呈现良好的正相关性，线性方程分别为y=231 530x-681.99（r=1.000 0）、y=136 409x+2 419.6（r=0.999 9）。
2.5 准确度、精密度和灵敏度
从表1可以看出，在添加质量浓度为0.01～1.00 mg/kg时，荔枝果肉中甲基硫菌灵的添加回收率为78.9%～97.6%，相对标准偏差为2.08%～3.95%;多菌灵添加回收率为79.8%～94.6%，相对标准偏差为3.04%～5.27%。2种农药的准确度、精密度和重现性均符合回收率在70%～120%、相对标准偏差低于20%的农药残留分析要求。
在上述前处理分析方法和HPLC仪器条件下，甲基硫菌灵最低检出量为0.1 ng，最小检出浓度为0.01 mg/kg;多菌灵的最低检出量为0.1 ng，最小检出浓度为0.01 mg/kg。
3 结论
该研究采用QuEChERS方法结合高效液相色谱技术，建立了甲基硫菌灵和多菌灵2种农药在荔枝果肉基质中残留量的前处理方法和液相检测分析条件，并讨论仪器条件、提取溶剂等相关参数。结果表明，该方法操作简便、快速、有机溶剂用量少，能够满足甲基硫菌灵和多菌灵在荔枝果肉基质中的残留检测分析要求。
参考文献
[1] 丁悦，吴若函，郭晓瑜，等.甲基硫菌灵及其代谢产物对2种非靶标生物的急性毒性和安全评价[J].农药，2013，52（12）：896-898.
[2] 刘文杰，万英，庞新安，等.高效液相色谱法同时测定土壤中多菌灵、吡虫啉和甲基托布津的残留[J].分析测试学报，2017，26（1）：133-135.
[3] 尤娟，郭宏斌，曾绍东，等.苯并咪唑类杀菌剂性质及检测技术[J].农药，2016，55（12）：859-863，876.
[4] 尹显慧，李荣玉，王梅，等.多菌灵和甲基硫菌灵在番茄和土壤中的残留分析[J].农药，2014，53（3）：191-193.
[5] 肖璐璐，王昱翔，王娅 等.甲基硫菌灵及其代谢产物多菌灵在柑橘中的残留及消解动态[J].农药，2018，57（4）：276-278，293.
[6] 陈伟，刘红彦，范芳婷，等.芝麻中甲基硫菌灵及代谢物多菌灵残留测定及安全性评价[J].农药，2011，50（12）：909-911，914.
[7] 裴欣，王继军，陈志永，等.黄瓜和土壤中甲基硫菌灵·戊唑醇的残留分析[J].农药，2012，51（4）：281-283.
[8] 苑学霞，梁京芸，王文博，等.苹果和土壤中甲基硫菌灵及其代谢物残留消解动态[J].生态环境学报，2016，25（1）：135-140.
[9] 周雪晴，謝艳丽，张青，等.高效液相色谱法测定香蕉中的多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵[J].化学分析计量，2012，21（2）：34-36.
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[11] 张念洁，吴信子，姜旭.高效液相色谱法同时测定人参中多菌灵和甲基硫菌灵农药残留的含量[J].现代食品科技，2013，29（4）：907-910.
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[14] 曹爱华，李义强，徐光军，等.高效液相色谱法同时测定烟草中吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵的残留量[J].中国烟草科学，2009，30（1）：31-34.
[15] 辜雪英，仇满珍，刘云珠.高效液相色谱法测定柑橘中多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和硫菌灵残留量[J].理化检验（化学分册），2010，46（7）：797-799.
關键词 甲基硫菌灵;多菌灵;荔枝果肉;高效液相色谱法;代谢物;残留量
中图分类号 TS207.5+3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）35-0174-03
甲基硫菌灵（thiophanatemethyl）是具有高效低毒的广谱性内吸杀菌剂，具有保护和治疗作用，广泛用于粮食、棉花、蔬菜、果树等多种作物上的病害防治，甲基硫菌灵在作物和土壤中使用后易转化为多菌灵[1-3]，我国规定甲基硫菌灵残留定义为甲基硫菌灵和多菌灵之和，以多菌灵表示。多菌灵（carbendazim）属于广谱低毒苯并咪唑类杀菌剂，广泛用于大田作物、蔬菜、果树和经济作物的子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门的许多病害防治。GB 2763—2016（食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量）中甲基硫菌灵仅在苹果、梨、葡萄和西瓜等4种水果上制定了最大残留限量标准，暂无荔枝。因此，通过建立甲基硫菌灵和多菌灵在荔枝果肉中的分析方法，为其后续在作物上的残留量测定提供方法指导。
目前，有关甲基硫菌灵和多菌灵的分析方法报道主要有采用HPLC和HPLC-MS方法测定其在番茄、柑橘、黄瓜、芝麻等作物上的残留[4-15]，而荔枝果肉中的分析方法鲜见报道。笔者通过高效液相色谱技术建立了甲基硫菌灵和多菌灵在荔枝果肉中的残留量分析方法，为监测市场荔枝产品中2种环境污染物提供了分析方法参考。
1 材料与方法
1.1 仪器
岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）;匀浆机（IKA-T18型，德国制造）;离心机（GTR-22-1型高速冷冻离心机，北京时代北利离心机有限公司）;氮吹仪（OA-SYS，美国Organomation公司）。
1.2 试剂
甲基硫菌灵和多菌灵标准品，纯度分别为99.5%和98.6%，均购自美国Chem Service公司;甲醇、乙腈（色谱纯）;甲酸（色谱纯，美国Fluka公司）;无水MgSO4和NaCl（国药集团化学试剂有限公司）;乙二胺N-丙基硅烷吸附剂（PSA）（上海安谱实验科技股份有限公司）。
1.3 样品前处理
1.3.1 样品预处理。
1.3.1.1 荔枝样本采集。随机在试验小区荔枝树的不同方向及上、中、下、里、外等不同部位用剪刀采集不少于2 kg生长正常、无病害、未喷施过甲基硫菌灵和多菌灵的荔枝空白个体，装入样本袋中，贴好标签，尽快送往实验室。
1.3.1.2 荔枝果肉样品。所有器具冲洗后，取田间荔枝残留样本剥去荔枝皮，取出果肉和果核，果核弃去，将果肉切碎混匀，用四分法缩分，分取250 g 样品2份，装入样品容器中，贴好标签，并贮存在-20 ℃低温冰箱中待用。
1.3.2 添加样品及检测。
称取20.0 g已制备好荔枝果肉样品于100 mL离心管中，分别从1、10、100 mg/L甲基硫菌灵和多菌灵混合标准溶液中吸取0.2 mL添加到已称好的果肉样品中，静置1 h，再加入40 mL 0.1%甲酸-乙腈提取，匀浆2 min，加入7 g NaCl，涡旋1 min，5 000 r/min离心5 min。取上层乙腈提取液20 mL（相当于10 g样品量）浓缩约50 μL，用乙腈定容至2 mL，待净化。
将2 mL乙腈提取液转移至加有150 mg无水MgSO4、50 mg PSA的离心管中，用手剧烈振荡，涡旋10 s，10 000 r/min离心2 min。取上清液过0.22 μm有机滤膜，待HPLC测定。
1.4 色谱条件
岛津LC-20A配二极管阵列紫外检测器，色谱柱为Wondasil C18-WR（250 mm×4.6 mm×5 μm），流动相为水/甲醇/乙腈/0.1%甲酸水溶液（体积比36.4∶3.0∶60.0∶0.6），流速为0.5 mL/min，波长272 nm，进样量为30 μL。
1.5 标准曲线制作
准确称取甲基硫菌灵和多菌灵标准品，用乙腈配成1 000 mg/L的标准溶液，采用系列稀释法稀释至所需的质量浓度0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L，以峰面积（y）对进样量（x）做图，建立甲基硫菌灵和多菌灵的标准曲线方程。
1.6 添加回收率测定
取荔枝果肉空白样品20.0 g，添加水平为0.01～1.00 mg/kg，重复5次，按照上述提取净化方法处理之后，用液相色谱仪器进行测定，计算添加回收率。
2 结果与分析
2.1 仪器条件优化
2.1.1 流动相选择。
比较了Wondasil C18-WR、Thermo batabasic-18和依利特Hypersil ODS2等3种反相色谱柱对甲基硫菌灵和多菌灵2种化合物峰型、保留时间、响应强度等的影响。结果显示，采用Thermo batabasic-18时，甲基硫菌灵色谱峰有分叉，不对称，且不能回归基线，多菌灵基线漂移;依利特Hypersil ODS2色谱柱，甲基硫菌灵峰型不对称，基线漂移，多菌灵响应值减弱;应用Wondasil C18-WR色谱柱，2种目标农药的峰型对称，基线稳定，响应值高，能达到完全分离。 2.1.2 流速选择。
采用Wondasil C18-WR色谱柱，分别设置流速为0.4和0.5 mL/min，比较甲基硫菌灵和多菌灵的保留时间、峰型等。结果发现，当流速为0.4 mL/min，甲基硫菌灵的峰型不对称，灵敏度降低;流速为0.5 mL/min，峰型对称，基线平稳，分离度较好，响应强度高。
2.2 提取剂选择
分别比较了丙酮和乙腈2种常用有机溶剂对荔枝果肉基质中甲基硫菌灵和多菌灵的提取效率，结果显示，当丙酮作为提取溶剂时，可将基质中的糖类等杂质与目标农药一并提取，样品黏稠，加大了净化难度，并可导致色谱柱、检测器的污染，此外，丙酮易溶于水，不易达到明显分层效果，不利于后续净化;乙腈中加入少量甲酸作为提取溶剂，可显著提高甲基硫菌灵和多菌灵在基质中的提取效率，且提取液较清澈，两相界面分层效果明显，适于作为荔枝果肉基质的提取剂。
2.3 净化条件优化
无水MgSO4主要作用是用于除去样品中的水分，确保目标分析物易被有机溶剂完全提取;PSA作为弱阴离子交换填料，能够有效去除基质中糖类、脂肪酸等物质。荔枝果肉中含有大量糖分、维生素、氨基酸等物质，采用PSA能够有效去除杂质干扰，确保目标分析物峰型对称、无拖尾。
2.4 线性范围
以甲基硫菌灵和多菌灵的浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标，在浓度为0.01～2.00 mg/L范围内2种目标农药的浓度与其响应峰面积呈现良好的正相关性，线性方程分别为y=231 530x-681.99（r=1.000 0）、y=136 409x+2 419.6（r=0.999 9）。
2.5 准确度、精密度和灵敏度
从表1可以看出，在添加质量浓度为0.01～1.00 mg/kg时，荔枝果肉中甲基硫菌灵的添加回收率为78.9%～97.6%，相对标准偏差为2.08%～3.95%;多菌灵添加回收率为79.8%～94.6%，相对标准偏差为3.04%～5.27%。2种农药的准确度、精密度和重现性均符合回收率在70%～120%、相对标准偏差低于20%的农药残留分析要求。
在上述前处理分析方法和HPLC仪器条件下，甲基硫菌灵最低检出量为0.1 ng，最小检出浓度为0.01 mg/kg;多菌灵的最低检出量为0.1 ng，最小检出浓度为0.01 mg/kg。
3 结论
该研究采用QuEChERS方法结合高效液相色谱技术，建立了甲基硫菌灵和多菌灵2种农药在荔枝果肉基质中残留量的前处理方法和液相检测分析条件，并讨论仪器条件、提取溶剂等相关参数。结果表明，该方法操作简便、快速、有机溶剂用量少，能够满足甲基硫菌灵和多菌灵在荔枝果肉基质中的残留检测分析要求。
参考文献
[1] 丁悦，吴若函，郭晓瑜，等.甲基硫菌灵及其代谢产物对2种非靶标生物的急性毒性和安全评价[J].农药，2013，52（12）：896-898.
[2] 刘文杰，万英，庞新安，等.高效液相色谱法同时测定土壤中多菌灵、吡虫啉和甲基托布津的残留[J].分析测试学报，2017，26（1）：133-135.
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[5] 肖璐璐，王昱翔，王娅 等.甲基硫菌灵及其代谢产物多菌灵在柑橘中的残留及消解动态[J].农药，2018，57（4）：276-278，293.
[6] 陈伟，刘红彦，范芳婷，等.芝麻中甲基硫菌灵及代谢物多菌灵残留测定及安全性评价[J].农药，2011，50（12）：909-911，914.
[7] 裴欣，王继军，陈志永，等.黄瓜和土壤中甲基硫菌灵·戊唑醇的残留分析[J].农药，2012，51（4）：281-283.
[8] 苑学霞，梁京芸，王文博，等.苹果和土壤中甲基硫菌灵及其代谢物残留消解动态[J].生态环境学报，2016，25（1）：135-140.
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[10] 张志勇，单炜力，简秋，等.甲基硫菌灵及其代谢物在不同种植模式黄瓜和土壤中的残留[J].农业环境科学学报，2012，31（6）：1077-1081.
[11] 张念洁，吴信子，姜旭.高效液相色谱法同时测定人参中多菌灵和甲基硫菌灵农药残留的含量[J].现代食品科技，2013，29（4）：907-910.
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[13] 徐炜枫，韩凯，孙钰洁，等.液质联用测定番茄中甲基硫菌灵残留量[J].农业资源与环境学报，2014，31（3）：296-298.
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