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【摘要】 妊娠孕妇外周血中或宫颈管内存在有胎儿细胞或遗传物质，利于各种方法富集它们并进行遗传分析，检测胎儿遗传病及染色体病，可达到无创性产前诊断的目的。
【关键词】 孕妇外周血；富集；胎儿细胞；无创性产前诊断
产前诊断是预防单基因疾病、染色体疾病主要的措施。然而目前的产前诊断方法主要利用侵入性方法获取绒毛细胞、羊水细胞、脐带血细胞标本进行疾病检测，这些有创性手术存在导致1-5%左右胎儿流产的风险。为解决这一难题，人们一直在寻求一种方法能够从母体中获取胎儿细胞或遗传物质进行遗产病的检查，实现无创性产前诊断。经过多年的研究，无创性产前诊断技术已经得到长足发展，并逐渐转向临床应用阶段，本文将主要阐述无创性产前诊断技术的发展过程，临床应用及未来展望。
1 母体中胎儿细胞或遗传物质
通过依据细胞的特性富集胎儿细胞或胎儿遗传物质，其中如胎儿的滋养细胞、淋巴细胞、有核红细胞、母体血浆中胎儿DNA或RNA等，都可以作为进行无创性产前诊断研究的对象。
1.1 滋养细胞：滋养层细胞主要分布在子宫血管组织和子宫腔内，于叶状绒毛膜转变成平滑绒毛膜过程中脱落和降解到达孕妇宫颈管， 1995年Rodeck等在经子宫颈细胞（transcervical cell TCC)的灌洗样本中检测出滋养层细胞成分,并且证实通过不同的方法约50%～70%经子宫颈可富集到胎儿细胞[1]。收集TCC细胞样本窗口期跨越孕7～13周。但因其多核特点及其与胎盘的嵌合现象，有致误诊可能。
1.2 淋巴细胞 自从walknownska首先发现了怀有男胎的孕妇外周血中含有胎儿淋巴细胞以来，人们通过主要组织相容性抗原分离鉴定胎儿淋巴细胞进行产前诊断[2]。但这类细胞存在一些不可避免的技术难题，由于在早孕期还没产生大量胎儿淋巴细胞，此时母血中的胎儿淋巴细胞的数目极少，因此，不能进行早期的产前诊断，限制了其临床上的应用。另外，胎儿淋巴细胞可长期存在于母体外周血，Diana W在母体外周血中发现了存在27年的胎儿淋巴细胞[3]，因此影响了检测的准确率，限制了胎儿淋巴细胞在无创性产前诊断的应用。
1.3 有核红细胞 胎儿有核红细胞（fetal nucleated red blood cells)十分适合于无创伤性产前诊断。在妊娠早期时胎儿有核红细胞的含量相对较高，在非妊娠成人中很少出现，其在血液中的生存期约为90天，因此孕妇外周血不会存在上次妊娠时遗留的胎儿有核红细胞。此外胎儿有核红细胞能够通过形态学进行分离。另外胎儿有核红细胞表达的转铁蛋白（CD71）、血型糖蛋白A潜在的胎儿特异性抗原（如HAE9抗原）对于富集和分离胎儿有核红细胞都是有用的生化标志[4]。
1.4 母体血浆游离胎儿核酸物质 1997年Lo等报道了在母体外周血中存在游离的胎儿脱氧核糖核酸（cell-free fetal DNA cffDNA），cffDNA来源于胎盘，可能由于滋养层细胞凋亡后其核酸物质释放到母体，孕妇怀孕4周后就能够被检测出，其半衰期很短，一旦释放入外周血7～11小时就被母体清除，这些特征使其很有潜力成为无创伤性产前诊断的胎儿物质[5]。然而在母体血中绝大多数游离DNA来自于母亲，游离的胎儿DNA仅占到3%-6%,在对cffDNA分离和鉴定提出了很高的要求，另外，母体血中胎儿mRNA是现在无创伤性产前诊断的又一研究热点。和游离的胎儿DNA一样，母体血中胎儿mRNA也主要来源于胎盘组织，胎儿mRNA已被用作研究、监测胎盘病理性妊娠的指标。有研究表明孕妇血浆中CRH mRNA浓度越高其发生子痫的风险越大[6]。
2 无创性产前诊断技术的应用
母体外周血中存在的胎儿细胞或核酸物质极其微量，又容易受母体血的干扰。因此对其分离和鉴定的要求也相当高，传统的产前诊断技术不能用于无创性产前诊断领域中。
2.1 胎儿有核红细胞富集术 有研究报道1ml母血仅含有一个胎儿有核红细胞，通常可采用以下几种方法进行富集：（1）利用胎儿有核红细胞的密度特征进行密度梯度离心；（2）采用流式细胞仪富集表达CD71的胎儿有核红细胞；（3）利用胎儿有核红细胞的核圆度、核形态、血红蛋白γ链染色强度和染色胞浆亮度等形态参数进行分离和富集[7]。用已分离和富集的胎兒细胞进行产前诊断的方法主要有PCR及FISH，可对遗传病、染色体病进行产前诊断。
2.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS） MALDI-TOF-MS能够高度准确的测定物质的质荷比，其分辨率是基因分析仪的100倍[8]。MALDI-TOF-MS与多种技术结合能够特异、灵敏的检测单个分子水平的DNA。2007年Lo等选择PLCA4编码区域的一个SNP位点，运用MALDI-TOF-MS、PCR、和碱基延伸等技术。根据染色体杂合子SNP其等位基因含量的比率不同，成功的对怀有21-三体胎儿的孕妇进行了无创伤性产前诊断，该法的灵敏度为90%、特异性达到96.5%。
2.3 数字PCR（Digital PCR）在无创伤性产前诊断中的应用 数字PCR是定量测定单一分子DNA扩增数来检测目标样本的技术。理论上数字PCR比实时定量PCR更加精确。 数字PCR包含同时对多个反应孔中最大度稀释度的的核酸样本的进行扩增，其阳性信号代表了单一分子模板扩增结果[9]。
扩增阳性信号占总的PCR反应数的比例反应了未经稀释的原液样本中模板的浓度。Y. M. Dennis Lo等运用数字PCR成功的对21-三体综合症进行无创伤性产前诊断[10]。
2.4 第二代测序技术在无创伤性产前诊断中的应用 第二代测序技术是结合微阵列技术而衍生出来的。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序[11]。Chiu利用第二代测序技术对血浆短片段DNA进行测序、并计量母体血浆的DNA分子数量，当母亲怀有21-三体患儿时，母亲血浆中21号染色体片段序列就会过量表达[12]。
3 总结与展望
随着我国产前筛查的广泛开展，每年有无数的孕妇需要进行染色体病或遗传病的产前诊断，然而侵入性产前诊断的风险及其给孕妇带来的焦虑使其不能完全被接受。无创性产前诊断为孕妇和胎儿提供了一种无风险的诊断途径。然而该技术实施和操作具有相当大的难度，成为其在临床上的应用与推广的阻力，如何将现有的技术转化到临床应用已成为未来无创性产前诊断研究重点。
参考文献
[1] Rodeck C, Tutschek B, Kingdom J, Sherlock J (1995) Methods for the collection of transcervical samples during the first trimester of gestation.Prenat Diagn 15:933-943
[2] walknownska J, conte FA,Grumbach MM. practice and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer [J].Lancet,1969,7606:1119-1122
[3] Diana W. Bianchi,Gretchen k et al Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum [J].Proc Natl 1996.93（1）:705-708
[4] Troeger C, Holzgreve W, Hahn S. A comparison of different density gradients and antibodies for enrichment of fetal erythroblasts by MACS. Prenat Diagn. 1999;19:521–526.
[5] Lo Y., Corbetta N., Chamberlain P., et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet 1997; 350: 485-7.
[6] Ng EK, Leung T., Tsui N., et al. The concentration of circulating corticotropin-releasing hormone mRNA in maternal plasma is increased in preeclampsia. Clin Chem 2003; 49: 727-31.
[7] Donghyun Cha，Brad Hogan, Ralph M,et al. A simple and sensitive erythroblast scoring system to identify fetal cells in maternal blood[J]. prenat Diagn,2003,23:68-73
[8] Tang, K., Shahgholi, M., Garcia, B. A., et al. (2002) Improvement in the apparentmass resolution of oligonucleotides by using 12C/14N-enriched samples. Anal.Chem. 74, 226–231.
[9] Vogelstein, B; Kinzler KW (1999). "Digital PCR". Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16): 9236–41.
[10] Lo YMD, Lun FMF, Chan KCA, Tsui NBY, Chong KC, Lau TK, Leung TY,Zee BCY, Cantor CR, Chiu RWK. From the cover: digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy.[J]Proc Natl Acad Sci USA 2007;104:13116–13121.
[11] Karl V. Voelkerding, Shale A. Dames, Jacob D. Durtschi. Next-Generation Sequencing:
From Basic Research to Diagnostics[J].Clinical Chemistry 2009 55:4 641-658
[12] Chiu, R.W.K. et al. (2008) Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20458–20463
【关键词】 孕妇外周血；富集；胎儿细胞；无创性产前诊断
产前诊断是预防单基因疾病、染色体疾病主要的措施。然而目前的产前诊断方法主要利用侵入性方法获取绒毛细胞、羊水细胞、脐带血细胞标本进行疾病检测，这些有创性手术存在导致1-5%左右胎儿流产的风险。为解决这一难题，人们一直在寻求一种方法能够从母体中获取胎儿细胞或遗传物质进行遗产病的检查，实现无创性产前诊断。经过多年的研究，无创性产前诊断技术已经得到长足发展，并逐渐转向临床应用阶段，本文将主要阐述无创性产前诊断技术的发展过程，临床应用及未来展望。
1 母体中胎儿细胞或遗传物质
通过依据细胞的特性富集胎儿细胞或胎儿遗传物质，其中如胎儿的滋养细胞、淋巴细胞、有核红细胞、母体血浆中胎儿DNA或RNA等，都可以作为进行无创性产前诊断研究的对象。
1.1 滋养细胞：滋养层细胞主要分布在子宫血管组织和子宫腔内，于叶状绒毛膜转变成平滑绒毛膜过程中脱落和降解到达孕妇宫颈管， 1995年Rodeck等在经子宫颈细胞（transcervical cell TCC)的灌洗样本中检测出滋养层细胞成分,并且证实通过不同的方法约50%～70%经子宫颈可富集到胎儿细胞[1]。收集TCC细胞样本窗口期跨越孕7～13周。但因其多核特点及其与胎盘的嵌合现象，有致误诊可能。
1.2 淋巴细胞 自从walknownska首先发现了怀有男胎的孕妇外周血中含有胎儿淋巴细胞以来，人们通过主要组织相容性抗原分离鉴定胎儿淋巴细胞进行产前诊断[2]。但这类细胞存在一些不可避免的技术难题，由于在早孕期还没产生大量胎儿淋巴细胞，此时母血中的胎儿淋巴细胞的数目极少，因此，不能进行早期的产前诊断，限制了其临床上的应用。另外，胎儿淋巴细胞可长期存在于母体外周血，Diana W在母体外周血中发现了存在27年的胎儿淋巴细胞[3]，因此影响了检测的准确率，限制了胎儿淋巴细胞在无创性产前诊断的应用。
1.3 有核红细胞 胎儿有核红细胞（fetal nucleated red blood cells)十分适合于无创伤性产前诊断。在妊娠早期时胎儿有核红细胞的含量相对较高，在非妊娠成人中很少出现，其在血液中的生存期约为90天，因此孕妇外周血不会存在上次妊娠时遗留的胎儿有核红细胞。此外胎儿有核红细胞能够通过形态学进行分离。另外胎儿有核红细胞表达的转铁蛋白（CD71）、血型糖蛋白A潜在的胎儿特异性抗原（如HAE9抗原）对于富集和分离胎儿有核红细胞都是有用的生化标志[4]。
1.4 母体血浆游离胎儿核酸物质 1997年Lo等报道了在母体外周血中存在游离的胎儿脱氧核糖核酸（cell-free fetal DNA cffDNA），cffDNA来源于胎盘，可能由于滋养层细胞凋亡后其核酸物质释放到母体，孕妇怀孕4周后就能够被检测出，其半衰期很短，一旦释放入外周血7～11小时就被母体清除，这些特征使其很有潜力成为无创伤性产前诊断的胎儿物质[5]。然而在母体血中绝大多数游离DNA来自于母亲，游离的胎儿DNA仅占到3%-6%,在对cffDNA分离和鉴定提出了很高的要求，另外，母体血中胎儿mRNA是现在无创伤性产前诊断的又一研究热点。和游离的胎儿DNA一样，母体血中胎儿mRNA也主要来源于胎盘组织，胎儿mRNA已被用作研究、监测胎盘病理性妊娠的指标。有研究表明孕妇血浆中CRH mRNA浓度越高其发生子痫的风险越大[6]。
2 无创性产前诊断技术的应用
母体外周血中存在的胎儿细胞或核酸物质极其微量，又容易受母体血的干扰。因此对其分离和鉴定的要求也相当高，传统的产前诊断技术不能用于无创性产前诊断领域中。
2.1 胎儿有核红细胞富集术 有研究报道1ml母血仅含有一个胎儿有核红细胞，通常可采用以下几种方法进行富集：（1）利用胎儿有核红细胞的密度特征进行密度梯度离心；（2）采用流式细胞仪富集表达CD71的胎儿有核红细胞；（3）利用胎儿有核红细胞的核圆度、核形态、血红蛋白γ链染色强度和染色胞浆亮度等形态参数进行分离和富集[7]。用已分离和富集的胎兒细胞进行产前诊断的方法主要有PCR及FISH，可对遗传病、染色体病进行产前诊断。
2.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS） MALDI-TOF-MS能够高度准确的测定物质的质荷比，其分辨率是基因分析仪的100倍[8]。MALDI-TOF-MS与多种技术结合能够特异、灵敏的检测单个分子水平的DNA。2007年Lo等选择PLCA4编码区域的一个SNP位点，运用MALDI-TOF-MS、PCR、和碱基延伸等技术。根据染色体杂合子SNP其等位基因含量的比率不同，成功的对怀有21-三体胎儿的孕妇进行了无创伤性产前诊断，该法的灵敏度为90%、特异性达到96.5%。
2.3 数字PCR（Digital PCR）在无创伤性产前诊断中的应用 数字PCR是定量测定单一分子DNA扩增数来检测目标样本的技术。理论上数字PCR比实时定量PCR更加精确。 数字PCR包含同时对多个反应孔中最大度稀释度的的核酸样本的进行扩增，其阳性信号代表了单一分子模板扩增结果[9]。
扩增阳性信号占总的PCR反应数的比例反应了未经稀释的原液样本中模板的浓度。Y. M. Dennis Lo等运用数字PCR成功的对21-三体综合症进行无创伤性产前诊断[10]。
2.4 第二代测序技术在无创伤性产前诊断中的应用 第二代测序技术是结合微阵列技术而衍生出来的。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序[11]。Chiu利用第二代测序技术对血浆短片段DNA进行测序、并计量母体血浆的DNA分子数量，当母亲怀有21-三体患儿时，母亲血浆中21号染色体片段序列就会过量表达[12]。
3 总结与展望
随着我国产前筛查的广泛开展，每年有无数的孕妇需要进行染色体病或遗传病的产前诊断，然而侵入性产前诊断的风险及其给孕妇带来的焦虑使其不能完全被接受。无创性产前诊断为孕妇和胎儿提供了一种无风险的诊断途径。然而该技术实施和操作具有相当大的难度，成为其在临床上的应用与推广的阻力，如何将现有的技术转化到临床应用已成为未来无创性产前诊断研究重点。
参考文献
[1] Rodeck C, Tutschek B, Kingdom J, Sherlock J (1995) Methods for the collection of transcervical samples during the first trimester of gestation.Prenat Diagn 15:933-943
[2] walknownska J, conte FA,Grumbach MM. practice and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer [J].Lancet,1969,7606:1119-1122
[3] Diana W. Bianchi,Gretchen k et al Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum [J].Proc Natl 1996.93（1）:705-708
[4] Troeger C, Holzgreve W, Hahn S. A comparison of different density gradients and antibodies for enrichment of fetal erythroblasts by MACS. Prenat Diagn. 1999;19:521–526.
[5] Lo Y., Corbetta N., Chamberlain P., et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet 1997; 350: 485-7.
[6] Ng EK, Leung T., Tsui N., et al. The concentration of circulating corticotropin-releasing hormone mRNA in maternal plasma is increased in preeclampsia. Clin Chem 2003; 49: 727-31.
[7] Donghyun Cha，Brad Hogan, Ralph M,et al. A simple and sensitive erythroblast scoring system to identify fetal cells in maternal blood[J]. prenat Diagn,2003,23:68-73
[8] Tang, K., Shahgholi, M., Garcia, B. A., et al. (2002) Improvement in the apparentmass resolution of oligonucleotides by using 12C/14N-enriched samples. Anal.Chem. 74, 226–231.
[9] Vogelstein, B; Kinzler KW (1999). "Digital PCR". Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16): 9236–41.
[10] Lo YMD, Lun FMF, Chan KCA, Tsui NBY, Chong KC, Lau TK, Leung TY,Zee BCY, Cantor CR, Chiu RWK. From the cover: digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy.[J]Proc Natl Acad Sci USA 2007;104:13116–13121.
[11] Karl V. Voelkerding, Shale A. Dames, Jacob D. Durtschi. Next-Generation Sequencing:
From Basic Research to Diagnostics[J].Clinical Chemistry 2009 55:4 641-658
[12] Chiu, R.W.K. et al. (2008) Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20458–20463