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[摘要] 目的 探讨急性淋巴细胞性白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）患儿骨髓中NF-κB的表达及临床意义。方法 选择ALL患儿80例，分为L1型、L2型、L3型三组，其中L1型30例、L2型25例、L3型25例；另选25例ALL患儿缓解组及15例缺铁性贫血患儿对照组；患儿均经相关临床检查确诊。采集患儿骨髓，单个核细胞分离，总RNA提取，逆转录合成cDNA，RT-PCR基因扩增，比较各实验组NF-κB表达情况。 结果 RT-PCR示，ALL组NF-κB mRNA表达量明显高于ALL缓解组及对照组（P<0.01）；ALL组NF-κB mRNA表达量L1、L2、L3型组间对比，差异无统计学意义（P>0.05）；ALL缓解组NF-κB mRNA的表达量虽高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 NF-κB高表达可能是急性淋巴细胞性白血病患儿发病的重要原因之一。
[关键词] NF-κB；急性淋巴细胞性白血病；RT-PCR；mRNA
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）18-0005-03
[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of NF-κB in bone marrow of children patients with acute lymphoblastic leukemia（ALL）. Methods 80 children patients with ALL were selected. It was divided into three groups： L1， L2 and L3. Among them， 30 cases were L1 type， 25 were L2 type， and 25 were L3 type. Another 25 children patients with ALL were selected in the remission group. 15 patients with iron deficiency anemia were selected in the control group； all children patients were diagnosed with relevant clinical examinations. Bone marrow was collected， single mononuclear cells were isolated， total RNA was extracted， cDNA was synthesized by reverse transcription， and RT-PCR gene was amplified. The expression of NF-κB in each experimental group was compared. Results RT-PCR showed that the expression of NF-κB mRNA in ALL group was significantly higher than that in ALL remission group and control group（P<0.01）； there was no statistically significant difference in the expression of NF-κB mRNA in ALL group between the L1， L2， and L3 types（P>0.05）. The expression of NF-κB mRNA in the ALL remission group was higher than that in the control group， but the difference was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion The high expression of NF-κB may be one of the important causes of the onset of children patients with acute lymphoblastic leukemia.
[Key words] NF-κB； ALL； RT-PCR； mRNA
NF-κB位于细胞核内，是细胞周期的重要调节因子，NF-κB调节细胞代谢存活；其通过影响靶基因，参与机体免疫介质活化、应激反应、炎症反应等[1]。研究显示[2]，成人急性淋巴细胞性白血病发病与NF-κB密切相关，在某些激励因子的作用下，NF-κB高表达，患者细胞无限增殖、代谢调节失灵、最终导致ALL发生；因此，本文将NF-κB作为研究靶点，进一步研究儿童ALL的发病机制，为ALL的进一步研究提供依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象选自2015年1月～2017年1月在我院住院的急性淋巴细胞白血病80例患儿。80例ALL包括L1、L2、L3型三组，其中L1型组30例，男15例，女15例，年龄3～9岁，平均（6.00±1.21）岁；L2型组25例，男15例，女10例，年龄3～10岁，平均（5.00±1.56）岁；L3型组25例，男15例，女10例，年龄3～9岁，平均（6.50±1.14）岁。对照组缺铁性贫血15例，男5例，女10例，年龄4～11岁，平均（7.50±1.03）岁。ALL缓解组25例，男15例，女10例，年龄3～8岁，平均（4.00±1.12）岁。患儿初次均根据细胞组织化学染色、外周血涂片、骨髓细胞形态學检测、临床表现等确诊，确诊患儿由监护人签署知情同意书，纳入各实验组。缺铁性贫血组，诊断标准依据张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[3]。常规采集患者骨髓，分离单个核细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，利用RT-PCR进行基因扩增，检测并比较各组NF-κB的表达情况。 1.2 实验方法
RNA反转录与提取：总RNA提取采用Trizol法，检测总RNA浓度及完整性，使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）进行反转录反应，按试剂盒说明操作，反转录反应条件：42℃ 62 min，72℃ 5 min，4℃ 5 min，保存备用于-20℃。PCR实时定量扩增：在实时荧光定量PCR（ABI3700）上进行扩增。TAKARA设计合成NF-κB基因引物。上游引物序列（5’ CTGAACCAG GGCATACCTGT3’），下游引物序列（5’ GAGAAGTCCATGTCCGCA AT3’），扩增产物197bp；内参GAPDH下游引物序列（5’ TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3’），扩增产物206 bp。PCR反应液SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA公司生产），反应体系为25 μL。反应条件为：3 min 95℃预变性、35sec 95℃变性、40 sec 70℃延伸、35 sec 56℃退火，如此40个循环，10 min 70℃延伸，绘制溶解曲线于间隔30 s后。
1.3 统计学分析
所有数据均利用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两样本比较采用t检验，多个样本比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NF-κB cDNA电泳扩增
内参及各组NF-κB cDNA琼脂凝胶电泳扩增结果，NF-κB扩增条带及内参扩增条带分别位于206 bp及197 bp左右。NF-κB RT-PCR結果显示：实时PCR扩增相当于0.01～100 ng总RNA的cDNA模板，制作溶解曲线和标准曲线。GAPDH、NF-κB扩增曲线中，溶解温度为87℃和90℃左右，说明PCR扩增，其产物为单一产物。GAPDH及NF-κB两者的扩增效率及标准曲线基本一致。见封三图1、2。
2.2 NF-κB mRNA RT-PCR结果
NF-κB mRNA在ALL中的表达：RT-PCR结果显示，NF-κB mRNA的表达量ALL组明显高于对照组及ALL缓解组，差异有显著性（P<0.01）；L1、L2、L3型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；ALL缓解组NF-κB mRNA的表达量虽高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3讨论
ALL是一种常见的血液系统恶性肿瘤，其发生与众多基因参与的细胞信号传导通路异常相关[4]，NF-κB通路即是影响ALL发生发展的重要通路之一。研究显示[5]，NF-κB可分为两大类，一类为活化体形式，另一类为失活体形式，当受细胞因子刺激后无活性的NF-κB可活化，进而进入细胞核内，参与靶基因调控。NF-κB活化后的高表达与肿瘤细胞增殖关系密切[6]，因此，本研究将NF-κB作为研究靶点，进一步研究儿童ALL的发病机制。
急性淋巴细胞性白血病（ALL）占儿童急性白血病的80%，发病率高峰在3～7岁之间。在急性白血病中，恶性细胞失去成熟和定向分化的能力。这些细胞迅速取代正常细胞。当恶性细胞取代正常的骨髓成分时即发生骨髓衰竭。急性淋巴细胞性白血病是一种进行性恶性疾病，其特征为大量的类似于淋巴母细胞的未成熟白细胞。这些细胞可在血液、骨髓、淋巴结、脾脏和其他器官中发现。根据细胞形态学和临床预后的不同，将ALL分为L1、L2、L3三个亚型。
研究发现[7-9]，多种致癌因子可激活NF-κB，活化的NF-κB能与多种细胞基因的κB位点结合，调节基因转录，抗细胞凋亡，使正常细胞向恶性转化、促进肿瘤细胞远处转移。NF-κB是启动子c-myc的重要调节因子[10-12]，其通过调节凋亡蛋白/抗凋亡蛋白的平衡，实现其抗凋亡功能；研究表明[13]，正常组NF-κB的表达低于初诊ALL患者，研究者推测NF-κB的抗凋亡作用可能参与了ALL的发展。体外研究表明[14]，某些化疗药可以提高NF-κB活性，NF-κB过度表达可以降低化疗药物的作用，也可以使肿瘤细胞产生抗药性。因此对NF-κB靶点的研究可为ALL寻找新的治疗途径。本研究显示，NF-κB mRNA在ALL中的表达：RT-PCR结果显示，NF-κB mRNA的表达量ALL组明显高于对照组及ALL缓解组，差异有显著性（P<0.01）；L1、L2、L3型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；ALL缓解组NF-κB mRNA的表达量虽高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05），说明NF-κB表达升高可能是急性淋巴细胞性白血病发病的重要原因之一。
研究证明[15]， NF-κB是一个多效性调控因子，白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤中均存在高表达的NF-κB，但导致NF-κB高表达的具体机制尚不清楚，机体的防御能力可被过度抑制NF-κB表达降低[16]。因此，研究NF-κB的抑制机制及活化与ALL发生发展的相关性，可为开发治疗ALL新药带来思路。
[参考文献]
[1] Brasier AR. The NF-kappa B regulatory network[J].Cardiovasc Toxicol，2006，6：111-130.
[2] Dolcet X，Llobet D，Pallares J，et al. NF-κB in development and progression of human cancer[J].Virchows Arch，2005，446（5）：231-234.
[3] 张之南. 血液病诊断及疗效标准[M]. 北京：科学出版社，2007：1. [4] Bueso-Ramos CE，Rocha FC，Shishodia S，et al. Expression of constitutively active nuclear-kappa B RelA transcription factor in blast of acute myeloid leukemia[J].Hum Pathol，2004，35：246-253.
[5] Djavaheri-Mergny M，Amelotti M，Mathieu J，et al.NF-kappaB activation represses tumor necrosis factor-alpha-induced autophagy[J].J Biol Chem，2006，281（41）：30373-30382.
[6] Monica L，Guzaman SJ，Nerring DU，et al.Nuclear factor-κB is constitutively activated in primitive human actue myelogenous leukemia cells[J].Blood，2001，15：2301-2304.
[7] Luo JM，Yoshida，Komura S，et al.Possible dominant-negative mutation of SHIP gene in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia，2003，17（5）：1-8.
[8] Hishiki T，Ohshima T，Ego T，et al.Bcl3 acts as a negative regulator of transcription from the human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat through interactions with TORC3[J].J Biol Chem，2007，28（2）：28335-28343.
[9] Carmody RJ，Ruan Q，Palmer S，et al.Negative regulation of Toll-like receptor signaling by NF-kappa B p50 ubiquitination blockade[J]. Science，2007，31（7）：675-678.
[10] Ma WK，Hang HC.The clinical research on treatment of integrative medicine to refractory and elapsed acute leukemia[J].Chin J Inform Tradit Chin Med，2009，16（5）：73-74.
[11] Perkins ND.Integrating cell-signalling pathways with NF-kappa B and IKK function[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（1）：49-51.
[12] Baumgartner B，Weber M，Quirling M，et al. Increased IkappaB kinase activity is associated with activated NF- kappa B in acute myeloid blasts[J]. Leukemia，2002，16（5）：2062-2071.
[13] 周文娣，祁海嘯，胡剑，等.儿童急性淋巴细胞白血病p16蛋白表达及DNA含量的临床研究[J]. 南京医科大学学报（自然科学版），2017，37（4）：485-487.
[14] 袁静，胡绍燕，柴忆欢，等. CCLG-2008方案治疗儿童急性淋巴细胞性白血病复发因素分析[J]. 临床儿科杂志，2016，34（5）：326-331.
[15] 厚玉姣，赵丽，刘祥鑫，等. 6-硫鸟嘌呤与6-巯嘌呤治疗儿童急性淋巴细胞白血病的研究进展[J]. 中国实验血液学杂志，2016，24（2）：622-626.
[16] 王鸿武，林丽敏. 儿童急性淋巴细胞性白血病化疗前后红细胞体积分布宽度的变化及临床意义[J]. 吉林医学，2016，37（12）：2887-2888.
（收稿日期：2018-02-08）
[关键词] NF-κB；急性淋巴细胞性白血病；RT-PCR；mRNA
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）18-0005-03
[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of NF-κB in bone marrow of children patients with acute lymphoblastic leukemia（ALL）. Methods 80 children patients with ALL were selected. It was divided into three groups： L1， L2 and L3. Among them， 30 cases were L1 type， 25 were L2 type， and 25 were L3 type. Another 25 children patients with ALL were selected in the remission group. 15 patients with iron deficiency anemia were selected in the control group； all children patients were diagnosed with relevant clinical examinations. Bone marrow was collected， single mononuclear cells were isolated， total RNA was extracted， cDNA was synthesized by reverse transcription， and RT-PCR gene was amplified. The expression of NF-κB in each experimental group was compared. Results RT-PCR showed that the expression of NF-κB mRNA in ALL group was significantly higher than that in ALL remission group and control group（P<0.01）； there was no statistically significant difference in the expression of NF-κB mRNA in ALL group between the L1， L2， and L3 types（P>0.05）. The expression of NF-κB mRNA in the ALL remission group was higher than that in the control group， but the difference was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion The high expression of NF-κB may be one of the important causes of the onset of children patients with acute lymphoblastic leukemia.
[Key words] NF-κB； ALL； RT-PCR； mRNA
NF-κB位于细胞核内，是细胞周期的重要调节因子，NF-κB调节细胞代谢存活；其通过影响靶基因，参与机体免疫介质活化、应激反应、炎症反应等[1]。研究显示[2]，成人急性淋巴细胞性白血病发病与NF-κB密切相关，在某些激励因子的作用下，NF-κB高表达，患者细胞无限增殖、代谢调节失灵、最终导致ALL发生；因此，本文将NF-κB作为研究靶点，进一步研究儿童ALL的发病机制，为ALL的进一步研究提供依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象选自2015年1月～2017年1月在我院住院的急性淋巴细胞白血病80例患儿。80例ALL包括L1、L2、L3型三组，其中L1型组30例，男15例，女15例，年龄3～9岁，平均（6.00±1.21）岁；L2型组25例，男15例，女10例，年龄3～10岁，平均（5.00±1.56）岁；L3型组25例，男15例，女10例，年龄3～9岁，平均（6.50±1.14）岁。对照组缺铁性贫血15例，男5例，女10例，年龄4～11岁，平均（7.50±1.03）岁。ALL缓解组25例，男15例，女10例，年龄3～8岁，平均（4.00±1.12）岁。患儿初次均根据细胞组织化学染色、外周血涂片、骨髓细胞形态學检测、临床表现等确诊，确诊患儿由监护人签署知情同意书，纳入各实验组。缺铁性贫血组，诊断标准依据张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[3]。常规采集患者骨髓，分离单个核细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，利用RT-PCR进行基因扩增，检测并比较各组NF-κB的表达情况。 1.2 实验方法
RNA反转录与提取：总RNA提取采用Trizol法，检测总RNA浓度及完整性，使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）进行反转录反应，按试剂盒说明操作，反转录反应条件：42℃ 62 min，72℃ 5 min，4℃ 5 min，保存备用于-20℃。PCR实时定量扩增：在实时荧光定量PCR（ABI3700）上进行扩增。TAKARA设计合成NF-κB基因引物。上游引物序列（5’ CTGAACCAG GGCATACCTGT3’），下游引物序列（5’ GAGAAGTCCATGTCCGCA AT3’），扩增产物197bp；内参GAPDH下游引物序列（5’ TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3’），扩增产物206 bp。PCR反应液SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA公司生产），反应体系为25 μL。反应条件为：3 min 95℃预变性、35sec 95℃变性、40 sec 70℃延伸、35 sec 56℃退火，如此40个循环，10 min 70℃延伸，绘制溶解曲线于间隔30 s后。
1.3 统计学分析
所有数据均利用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两样本比较采用t检验，多个样本比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NF-κB cDNA电泳扩增
内参及各组NF-κB cDNA琼脂凝胶电泳扩增结果，NF-κB扩增条带及内参扩增条带分别位于206 bp及197 bp左右。NF-κB RT-PCR結果显示：实时PCR扩增相当于0.01～100 ng总RNA的cDNA模板，制作溶解曲线和标准曲线。GAPDH、NF-κB扩增曲线中，溶解温度为87℃和90℃左右，说明PCR扩增，其产物为单一产物。GAPDH及NF-κB两者的扩增效率及标准曲线基本一致。见封三图1、2。
2.2 NF-κB mRNA RT-PCR结果
NF-κB mRNA在ALL中的表达：RT-PCR结果显示，NF-κB mRNA的表达量ALL组明显高于对照组及ALL缓解组，差异有显著性（P<0.01）；L1、L2、L3型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；ALL缓解组NF-κB mRNA的表达量虽高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3讨论
ALL是一种常见的血液系统恶性肿瘤，其发生与众多基因参与的细胞信号传导通路异常相关[4]，NF-κB通路即是影响ALL发生发展的重要通路之一。研究显示[5]，NF-κB可分为两大类，一类为活化体形式，另一类为失活体形式，当受细胞因子刺激后无活性的NF-κB可活化，进而进入细胞核内，参与靶基因调控。NF-κB活化后的高表达与肿瘤细胞增殖关系密切[6]，因此，本研究将NF-κB作为研究靶点，进一步研究儿童ALL的发病机制。
急性淋巴细胞性白血病（ALL）占儿童急性白血病的80%，发病率高峰在3～7岁之间。在急性白血病中，恶性细胞失去成熟和定向分化的能力。这些细胞迅速取代正常细胞。当恶性细胞取代正常的骨髓成分时即发生骨髓衰竭。急性淋巴细胞性白血病是一种进行性恶性疾病，其特征为大量的类似于淋巴母细胞的未成熟白细胞。这些细胞可在血液、骨髓、淋巴结、脾脏和其他器官中发现。根据细胞形态学和临床预后的不同，将ALL分为L1、L2、L3三个亚型。
研究发现[7-9]，多种致癌因子可激活NF-κB，活化的NF-κB能与多种细胞基因的κB位点结合，调节基因转录，抗细胞凋亡，使正常细胞向恶性转化、促进肿瘤细胞远处转移。NF-κB是启动子c-myc的重要调节因子[10-12]，其通过调节凋亡蛋白/抗凋亡蛋白的平衡，实现其抗凋亡功能；研究表明[13]，正常组NF-κB的表达低于初诊ALL患者，研究者推测NF-κB的抗凋亡作用可能参与了ALL的发展。体外研究表明[14]，某些化疗药可以提高NF-κB活性，NF-κB过度表达可以降低化疗药物的作用，也可以使肿瘤细胞产生抗药性。因此对NF-κB靶点的研究可为ALL寻找新的治疗途径。本研究显示，NF-κB mRNA在ALL中的表达：RT-PCR结果显示，NF-κB mRNA的表达量ALL组明显高于对照组及ALL缓解组，差异有显著性（P<0.01）；L1、L2、L3型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；ALL缓解组NF-κB mRNA的表达量虽高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05），说明NF-κB表达升高可能是急性淋巴细胞性白血病发病的重要原因之一。
研究证明[15]， NF-κB是一个多效性调控因子，白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤中均存在高表达的NF-κB，但导致NF-κB高表达的具体机制尚不清楚，机体的防御能力可被过度抑制NF-κB表达降低[16]。因此，研究NF-κB的抑制机制及活化与ALL发生发展的相关性，可为开发治疗ALL新药带来思路。
[参考文献]
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[2] Dolcet X，Llobet D，Pallares J，et al. NF-κB in development and progression of human cancer[J].Virchows Arch，2005，446（5）：231-234.
[3] 张之南. 血液病诊断及疗效标准[M]. 北京：科学出版社，2007：1. [4] Bueso-Ramos CE，Rocha FC，Shishodia S，et al. Expression of constitutively active nuclear-kappa B RelA transcription factor in blast of acute myeloid leukemia[J].Hum Pathol，2004，35：246-253.
[5] Djavaheri-Mergny M，Amelotti M，Mathieu J，et al.NF-kappaB activation represses tumor necrosis factor-alpha-induced autophagy[J].J Biol Chem，2006，281（41）：30373-30382.
[6] Monica L，Guzaman SJ，Nerring DU，et al.Nuclear factor-κB is constitutively activated in primitive human actue myelogenous leukemia cells[J].Blood，2001，15：2301-2304.
[7] Luo JM，Yoshida，Komura S，et al.Possible dominant-negative mutation of SHIP gene in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia，2003，17（5）：1-8.
[8] Hishiki T，Ohshima T，Ego T，et al.Bcl3 acts as a negative regulator of transcription from the human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat through interactions with TORC3[J].J Biol Chem，2007，28（2）：28335-28343.
[9] Carmody RJ，Ruan Q，Palmer S，et al.Negative regulation of Toll-like receptor signaling by NF-kappa B p50 ubiquitination blockade[J]. Science，2007，31（7）：675-678.
[10] Ma WK，Hang HC.The clinical research on treatment of integrative medicine to refractory and elapsed acute leukemia[J].Chin J Inform Tradit Chin Med，2009，16（5）：73-74.
[11] Perkins ND.Integrating cell-signalling pathways with NF-kappa B and IKK function[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（1）：49-51.
[12] Baumgartner B，Weber M，Quirling M，et al. Increased IkappaB kinase activity is associated with activated NF- kappa B in acute myeloid blasts[J]. Leukemia，2002，16（5）：2062-2071.
[13] 周文娣，祁海嘯，胡剑，等.儿童急性淋巴细胞白血病p16蛋白表达及DNA含量的临床研究[J]. 南京医科大学学报（自然科学版），2017，37（4）：485-487.
[14] 袁静，胡绍燕，柴忆欢，等. CCLG-2008方案治疗儿童急性淋巴细胞性白血病复发因素分析[J]. 临床儿科杂志，2016，34（5）：326-331.
[15] 厚玉姣，赵丽，刘祥鑫，等. 6-硫鸟嘌呤与6-巯嘌呤治疗儿童急性淋巴细胞白血病的研究进展[J]. 中国实验血液学杂志，2016，24（2）：622-626.
[16] 王鸿武，林丽敏. 儿童急性淋巴细胞性白血病化疗前后红细胞体积分布宽度的变化及临床意义[J]. 吉林医学，2016，37（12）：2887-2888.
（收稿日期：2018-02-08）