探讨不同浓度不同作用时间下脂多糖(LPS)对A549细胞炎性因子基因表达的影响,为进一步确立急性呼吸窘迫综合征(ARDS)细胞模型的最适浓度-时间条件奠定基础。
方法取A549细胞,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37 ℃、5%CO2培养箱常规培养,取对数生长期的A549细胞进行传代,计数细胞并调整细胞密度为(5~7)×105个,于6孔板中培养2 d,当细胞融合至50%~60%时换无血清培养基DMEM培养12 h。取10 mg LPS加入10 mL DMEM培养基振荡混匀,配制1 g/L储存液;取0.5、1.0、2.5 mL的LPS储存液用DMEM溶液稀释定容至50 mL,配制成0、10、20、50 mg/L的LPS工作液。然后以0、10、20、50 mg/L的LPS分别作用0、1、3、5 h,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞白细胞介素(IL-6、IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达,以10 mg/L的LPS作用0 h为时间对照组,以0 mg/L的LPS作用1 h为浓度对照组,采用2-ΔΔCt法计算基因表达量。
结果①时间因素方面,在相同LPS浓度作用下,A549细胞经10 mg/L的LPS作用1 h时IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平均明显高于0 h时〔IL-6 mRNA(2-ΔΔCt):5.71±0.42比1.00±0.00,IL-1β mRNA(2-ΔΔCt):5.63±0.30比1.00±0.00,TNF-α mRNA(2-ΔΔCt):5.38±0.61比1.00±0.00,均P<0.01〕,其他时间点间细胞炎性因子基因表达水平均无明显改变。②浓度因素方面,在相同作用时间下,A549细胞经10 mg/L的LPS作用1 h时IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平均明显高于0 mg/L的LPS作用1 h时〔IL-6 mRNA(2-ΔΔCt):5.70±0.64比1.00±0.00,IL-1β mRNA(2-ΔΔCt):6.25±0.25比1.00±0.00,TNF-α mRNA(2-ΔΔCt):5.57±0.25比1.00±0.00,均P<0.01〕,其他浓度LPS组间炎性因子基因表达水平均无明显改变。
结论10 mg/L的LPS作用A549细胞1 h为建立ARDS细胞模型的最适作用浓度-时间条件。