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摘要：目的：探讨长期有氧运动对糖尿病大鼠主动脉晚期糖基化终产物形成及其与胶原代谢的关系。方法：通过高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）构建2型糖尿病SD大鼠模型。将SD大鼠分为正常对照组（C）、糖尿病模型组（D）和糖尿病运动组（DE）。糖尿病运动组（DE）大鼠进行不负重游泳运动12周。实验结束后检测大鼠血液GLU、GHb、GSP、Insulin、TG、TC、HDL-C、LDL-C和主动脉AGEs、Hyp、SOD、MDA及Col I、Col IV、FN表达的变化，并对实验结果进行统计分析。结果：与正常对照组（C）相比，糖尿病模型组（D）的血液GLU、GHb、GSP、Insulin、TG、TC、LDL-C水平显著升高（P<0.05或P<0.01），主动脉AGEs、Hyp、MDA含量和Col I、Col IV、FN表达水平均显著升高（P<0.01），血液HDL-C和主动脉SOD水平显著降低（P<0.01）；与糖尿病模型组（D）相比，糖尿病运动组（DE）的血液GLU、GHb、GSP、TG、TC、LDL-C水平显著降低（P<0.01），主动脉AGEs、Hyp、MDA含量和Col I、Col IV、FN表达显著降低（P<0.01），SOD显著升高（P<0.01）。结论：长期有氧运动可改善2型糖尿病大鼠主动脉间质胶原沉积的现象，这可能与运动降低血糖、主动脉AGEs含量和氧化应激水平有关。
关键词：2型糖尿病；有氧运动；主动脉；胶原代谢
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2013）05-0047-05
糖尿病大血管病变是2型糖尿病最常见的慢性并发症之一，是导致糖尿病致死致残的重要原因之一[1]。糖尿病大血管病变的特点是血管平滑肌细胞、血管壁间质胶原随着病程进行性增加，血管壁间质胶原增加可导致血管硬度增加，表现为血管收缩、舒张功能障碍[2]。Castellar A等[3]和Searls YM等[4]分别通过天狼猩红染色技术和透射电子显微镜技术观察到运动可显著降低糖尿病大鼠心肌胶原含量，但运动对糖尿病大血管胶原代谢影响的研究却很少见。本研究通过高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）构建2型糖尿病大鼠模型，观察运动对糖尿病大鼠主动脉胶原代谢的影响，并对其可能作用机制进行探讨。
1.3主要试剂
链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司，Ⅰ型胶原（Col I）、Ⅳ胶原（Col IV）、纤维连接蛋白（FN）一抗、二抗和DAB显色试剂购自北京博奥森生物科技有限公司，血糖（GLU）、糖化血红蛋白（GHb）、糖化血清蛋白（GSP）、羟脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）和超氧化物岐化酶（SOD）含量检测试剂盒购自南京建成生物研究所，甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）试剂盒购自中生北控生物股份有限公司，晚期糖基化终产物（AGEs）、胰岛素（Insulin）酶联免疫检测试剂盒购自上海蓝基生物科技公司。
1.4动物取材和指标检测
至12周游泳运动结束时，糖尿病模型组（D）余13只，糖尿病运动组（DE）余11只。在游泳运动第12周周末，所有大鼠过夜禁食12h后，将大鼠称重后腹腔麻醉，剖腹，从腹主动脉取血，3 000 rpm离心20 min，取血清置于-80℃冰箱保存待测。取胸主动脉组织置于4%多聚甲醛中固定以备免疫组化检测，另取腹主动脉置于 -80℃冰箱保存以做AGEs、Hyp、MDA、SOD含量检测。
3讨论
3.1运动训练对2型糖尿病大鼠血液指标的影响
本研究采用国内外公认的高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）的方法复制2型糖尿病（T2DM）大鼠模型。本实验结果表明，造模组大鼠空腹血糖明显升高，脂质代谢紊乱，这与文献报道相一致[8]。经过12周的实验周期，2型糖尿病动物模型仍表现出中度高血糖、中度高胰岛素血症、胰岛素抵抗和脂代谢紊乱的主要临床特征，表明2型糖尿病大鼠模型建模成功。GHb和GSP分别是血液中血红蛋白、血浆中蛋白质与糖类经过缓慢、连续的非酶促反应生成的产物，GHb和GSP合成速率、浓度与血糖水平呈正相关，分别从长期和短期反映了机体血糖浓度变化，是临床糖尿病病人诊断和评估血糖控制水平的良好指标[9]。本研究表明，长期有氧运动可显著降低2型糖尿病大鼠GLU、GHb、GSP和TG、TC、LDL-C水平，提示运动可改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱的现象，这可能与运动增加机体能量消耗，促进机体对葡萄糖的吸收和脂类的利用有关。
3.2运动训练对2型糖尿病主动脉胶原含量的影响及可能机制
已有研究表明，晚期糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）是引起糖尿病大血管病变的重要机制之一[11]。AGEs是还原糖如葡萄糖等的羰基与蛋白质、脂质和DNA的游离氨基端通过非酶糖基化作用形成的不可逆终末产物[12]。氧化应激可促进AGEs的形成，同时AGEs的形成过程也能诱导更强的氧化应激参与机体损伤。由于AGEs的形成需几周甚至几个月，因此通常只发生于半衰期长、转换率低的蛋白质，如胶原蛋白、纤维蛋白原、血红蛋白等。血管胶原蛋白的半衰期可长达2个多月，因而是胶原蛋白-AGEs交联的好发部位。AGEs-胶原蛋白交联一方面使胶原纤维的机械强度增加，顺应性降低；另一方面使胶原纤维间的结构稳定性增加，溶解度降低，胶原纤维在组织中堆积。已有研究证实，AGEs可刺激血管壁细胞间质中胶原蛋白合成，增加血管壁僵硬度，降低血管壁弹性[13]。本研究发现，2型糖尿病大鼠模型已表现出主动脉AGEs含量和Hyp、Col I、Col IV、FN显著升高的现象，这与前人的研究结果一致[13-15]。而运动对主动脉AGEs和胶原含量均具有下降作用。 AGEs除直接与血管壁间质胶原发生交联外，还与其受体RAGE（receptor for advanced glycation end products）结合参与血管壁胶原代谢的信号传导通路，促进胶原合成增加、降解减少。AGEs与其受体RAGE结合，激活各种信号传导通路，如：MAPK、PI3K、NADPH等，诱导细胞内氧化应激，氧化应激的升高一方面促进AGEs的合成及其受体RAGE蛋白表达水平上升[16]，同时还可促进对氧化还原敏感的核转录因子NF-κB的表达，NF-κB 激活和表达可调节多种细胞因子的基因表达[17-18]，如 TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6 等，这些细胞因子可促使血管壁炎症加重、细胞凋亡和胶原合成增加。本研究显示，运动可有效降低2型糖尿病大鼠主动脉AGEs含量，这与运动降低正常人体血清[19-20]和肥胖糖尿病Zucker大鼠肾脏[21]AGEs水平的研究结论一致。运动降低2型糖尿病大鼠主动脉AGEs含量，可能机制有：1）高血糖是引起AGEs生成的直接因素，运动可显著降低2型糖尿病大鼠血糖水平，进而降低AGEs的生成。2）AGEs的形成过程产生氧化应激，同时氧化应激也可促进AGEs的形成。运动对糖尿病机体具有抗氧化、抗炎作用[22]，因此可减少AGEs的生成。此外，2型糖尿病大鼠主动脉SOD水平显著降低、MDA水平显著升高，说明主动脉存在氧化应激加剧的现象。运动降低了2型糖尿病大鼠主动脉的氧化应激水平，这可能与运动降低AGEs的生成和运动的抗氧化功能有关。
鉴于上述AGEs、氧化应激与胶原代谢的关系，运动的降血糖、抗氧化作用不但降低了2型糖尿病大鼠主动脉的氧化应激水平，而且阻抑了主动脉AGEs生成以及AGEs生成过程中所产生的氧化应激，从而阻断或减弱了下游由氧化应激所引起的与刺激胶原合成有关细胞因子的表达反应链，直接或者间接起到了对动脉壁的保护作用，具体的信号传导通路有待于进一步的研究。
参考文献：
[1]stergaard J， Hansen TK， Thiel S，et al.Complement activation and diabetic vascular complications [J]. Clin Chim Acta， 2005， 361（1-2）： 10-19.
[2]徐瑞生， 姜宗来， 张传森， 等. 糖尿病大鼠主动脉的重建[J]. 解剖学报， 2000， 31 （1）： 78-81.
[3]Castellar A， Remedio RN， Barbosa RA，et al.Collagen and reticular fibers in left ventricular muscle in diabetic rats： physical exercise prevents its changes[J].Tissue Cell， 2011， 43（1）： 24-28.
[4]Searls YM， Smirnova IV， Fegley BR，et al.Exercise attenuates diabetes-induced ultrastructural changes in rat cardiac tissue[J]. Med Sci Sports Exerc， 2004， 36（11）： 1863-1870.
[5] Reed MJ，Meszaros K，Entes LJ，et al.A new rat model of type 2 diabetes： the fat-fed，streptozotocin-treated rat[J].Metabolism，2000， 49（11）：1390-1394.
[6] Srinivasan K， Viswanad B， Asrat L，et al.Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat： a model for type 2 diabetes and pharmacological screening[J]. Pharmacol Res， 2005， 52（4）： 313-320.
[7] Claude Lajoie， Angelino Calderone，Francois Trudeau，et al.Exercise training attenuated the PKB and GSK-3 dephosphorylation in the myocardium of ZDF rats[J]. J Appl Physiol， 2004， 96： 1606-1612.
[8] Mcgarry J D. Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes[J].Diabetes，2002，51（1）：7-18.
[9] 王婧茹，赵晶晶，叶春玲，等. 番石榴叶总三萜对2型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用[J].中国病理生理杂志，2012，28（6）： 1109-1113.
[10]Yu Hongjing， KuanHsingchen， ShuHanyang，et al.Resveratrol ameliorates vasculopathy in STZ-induced diabetic rats： role of AGE-RAGE signalling？ [J]. Diabetes Metab Res Rev， 2010， 26： 212-222.
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[13] Forbes JM， Yee LT， Thallas V，et al.Advanced glycation end product interventions reduce diabetes-accelerated atherosclerosis[J]. Diabetes， 2004， 53（7）： 1813-1823.
[14]罗海燕， 张卓， 陈昌华. 葛根素对实验性糖尿病大鼠主动脉Ⅳ型胶原基因表达的抑制作用[J]. 沈阳药科大学学报， 2007， 24（6）： 360-365.
[15]殷桂香， 曹玉莉， 朱德增. 酸味中药复方对2型糖尿病大鼠主动脉AGEs含量及受体基因表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志， 2009， 29（8）： 725-728.
[16]Aragno M， Mastrocola R， Alloatti G，et al.Oxidative stress triggers cardiac fibrosis in the heart of diabetic rats[J]. Endocrinology. 2008， 149（1）： 380-388.
[17]尹梅，高海青，李保应，等. 通心络对糖尿病大鼠心肌RAGE、NF-κB 的影响[J]. 山东大学学报：医学版， 2011， 49（8）： 16-20.
[18]S Chen， Z A Khan， M Cukiernik，et al.“Differential activation of NF-κB and AP-1 in increased fibronectin synthesis in target organs of diabetic complications” [J]. American Journal of Physiology， 2003， 284（6）： E1089-E1097.
[19]Goon J A， Aini A H， Musalmah M，et al.Effect of Tai Chi exercise on DNA damage， antioxidant enzymes， and oxidative stress in middle-age adults[J]. J Phys Act Health， 2009， 6（1）： 43-54.
[20]Yoshikawa T， Miyazaki A， Fujimoto S. Decrease in serum levels of advanced glycation end-products by short-term lifestyle modification in non-diabetic middle-aged females[J]. Med Sci Monit， 2009， 15（6）： 65-73.
[21]Boor P， Celec P， Behuliak M，et al.Regular moderate exercise reduces advanced glycation and ameliorates early diabetic nephropathy in obese Zucker rats[J]. Metabolism， 2009， 58（11）： 1669-1677.
[22]De Lemos ET， Oliveira J， Pinheiro JP，et al.Regular physical exercise as a strategy to improve antioxidant and anti-inflammatory status： benefits in type 2 diabetes mellitus[J]. Oxid Med Cell Longev， 2012，（12）： 41-45.
关键词：2型糖尿病；有氧运动；主动脉；胶原代谢
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2013）05-0047-05
糖尿病大血管病变是2型糖尿病最常见的慢性并发症之一，是导致糖尿病致死致残的重要原因之一[1]。糖尿病大血管病变的特点是血管平滑肌细胞、血管壁间质胶原随着病程进行性增加，血管壁间质胶原增加可导致血管硬度增加，表现为血管收缩、舒张功能障碍[2]。Castellar A等[3]和Searls YM等[4]分别通过天狼猩红染色技术和透射电子显微镜技术观察到运动可显著降低糖尿病大鼠心肌胶原含量，但运动对糖尿病大血管胶原代谢影响的研究却很少见。本研究通过高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）构建2型糖尿病大鼠模型，观察运动对糖尿病大鼠主动脉胶原代谢的影响，并对其可能作用机制进行探讨。
1.3主要试剂
链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司，Ⅰ型胶原（Col I）、Ⅳ胶原（Col IV）、纤维连接蛋白（FN）一抗、二抗和DAB显色试剂购自北京博奥森生物科技有限公司，血糖（GLU）、糖化血红蛋白（GHb）、糖化血清蛋白（GSP）、羟脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）和超氧化物岐化酶（SOD）含量检测试剂盒购自南京建成生物研究所，甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）试剂盒购自中生北控生物股份有限公司，晚期糖基化终产物（AGEs）、胰岛素（Insulin）酶联免疫检测试剂盒购自上海蓝基生物科技公司。
1.4动物取材和指标检测
至12周游泳运动结束时，糖尿病模型组（D）余13只，糖尿病运动组（DE）余11只。在游泳运动第12周周末，所有大鼠过夜禁食12h后，将大鼠称重后腹腔麻醉，剖腹，从腹主动脉取血，3 000 rpm离心20 min，取血清置于-80℃冰箱保存待测。取胸主动脉组织置于4%多聚甲醛中固定以备免疫组化检测，另取腹主动脉置于 -80℃冰箱保存以做AGEs、Hyp、MDA、SOD含量检测。
3讨论
3.1运动训练对2型糖尿病大鼠血液指标的影响
本研究采用国内外公认的高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）的方法复制2型糖尿病（T2DM）大鼠模型。本实验结果表明，造模组大鼠空腹血糖明显升高，脂质代谢紊乱，这与文献报道相一致[8]。经过12周的实验周期，2型糖尿病动物模型仍表现出中度高血糖、中度高胰岛素血症、胰岛素抵抗和脂代谢紊乱的主要临床特征，表明2型糖尿病大鼠模型建模成功。GHb和GSP分别是血液中血红蛋白、血浆中蛋白质与糖类经过缓慢、连续的非酶促反应生成的产物，GHb和GSP合成速率、浓度与血糖水平呈正相关，分别从长期和短期反映了机体血糖浓度变化，是临床糖尿病病人诊断和评估血糖控制水平的良好指标[9]。本研究表明，长期有氧运动可显著降低2型糖尿病大鼠GLU、GHb、GSP和TG、TC、LDL-C水平，提示运动可改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱的现象，这可能与运动增加机体能量消耗，促进机体对葡萄糖的吸收和脂类的利用有关。
3.2运动训练对2型糖尿病主动脉胶原含量的影响及可能机制
已有研究表明，晚期糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）是引起糖尿病大血管病变的重要机制之一[11]。AGEs是还原糖如葡萄糖等的羰基与蛋白质、脂质和DNA的游离氨基端通过非酶糖基化作用形成的不可逆终末产物[12]。氧化应激可促进AGEs的形成，同时AGEs的形成过程也能诱导更强的氧化应激参与机体损伤。由于AGEs的形成需几周甚至几个月，因此通常只发生于半衰期长、转换率低的蛋白质，如胶原蛋白、纤维蛋白原、血红蛋白等。血管胶原蛋白的半衰期可长达2个多月，因而是胶原蛋白-AGEs交联的好发部位。AGEs-胶原蛋白交联一方面使胶原纤维的机械强度增加，顺应性降低；另一方面使胶原纤维间的结构稳定性增加，溶解度降低，胶原纤维在组织中堆积。已有研究证实，AGEs可刺激血管壁细胞间质中胶原蛋白合成，增加血管壁僵硬度，降低血管壁弹性[13]。本研究发现，2型糖尿病大鼠模型已表现出主动脉AGEs含量和Hyp、Col I、Col IV、FN显著升高的现象，这与前人的研究结果一致[13-15]。而运动对主动脉AGEs和胶原含量均具有下降作用。 AGEs除直接与血管壁间质胶原发生交联外，还与其受体RAGE（receptor for advanced glycation end products）结合参与血管壁胶原代谢的信号传导通路，促进胶原合成增加、降解减少。AGEs与其受体RAGE结合，激活各种信号传导通路，如：MAPK、PI3K、NADPH等，诱导细胞内氧化应激，氧化应激的升高一方面促进AGEs的合成及其受体RAGE蛋白表达水平上升[16]，同时还可促进对氧化还原敏感的核转录因子NF-κB的表达，NF-κB 激活和表达可调节多种细胞因子的基因表达[17-18]，如 TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6 等，这些细胞因子可促使血管壁炎症加重、细胞凋亡和胶原合成增加。本研究显示，运动可有效降低2型糖尿病大鼠主动脉AGEs含量，这与运动降低正常人体血清[19-20]和肥胖糖尿病Zucker大鼠肾脏[21]AGEs水平的研究结论一致。运动降低2型糖尿病大鼠主动脉AGEs含量，可能机制有：1）高血糖是引起AGEs生成的直接因素，运动可显著降低2型糖尿病大鼠血糖水平，进而降低AGEs的生成。2）AGEs的形成过程产生氧化应激，同时氧化应激也可促进AGEs的形成。运动对糖尿病机体具有抗氧化、抗炎作用[22]，因此可减少AGEs的生成。此外，2型糖尿病大鼠主动脉SOD水平显著降低、MDA水平显著升高，说明主动脉存在氧化应激加剧的现象。运动降低了2型糖尿病大鼠主动脉的氧化应激水平，这可能与运动降低AGEs的生成和运动的抗氧化功能有关。
鉴于上述AGEs、氧化应激与胶原代谢的关系，运动的降血糖、抗氧化作用不但降低了2型糖尿病大鼠主动脉的氧化应激水平，而且阻抑了主动脉AGEs生成以及AGEs生成过程中所产生的氧化应激，从而阻断或减弱了下游由氧化应激所引起的与刺激胶原合成有关细胞因子的表达反应链，直接或者间接起到了对动脉壁的保护作用，具体的信号传导通路有待于进一步的研究。
参考文献：
[1]stergaard J， Hansen TK， Thiel S，et al.Complement activation and diabetic vascular complications [J]. Clin Chim Acta， 2005， 361（1-2）： 10-19.
[2]徐瑞生， 姜宗来， 张传森， 等. 糖尿病大鼠主动脉的重建[J]. 解剖学报， 2000， 31 （1）： 78-81.
[3]Castellar A， Remedio RN， Barbosa RA，et al.Collagen and reticular fibers in left ventricular muscle in diabetic rats： physical exercise prevents its changes[J].Tissue Cell， 2011， 43（1）： 24-28.
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[15]殷桂香， 曹玉莉， 朱德增. 酸味中药复方对2型糖尿病大鼠主动脉AGEs含量及受体基因表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志， 2009， 29（8）： 725-728.
[16]Aragno M， Mastrocola R， Alloatti G，et al.Oxidative stress triggers cardiac fibrosis in the heart of diabetic rats[J]. Endocrinology. 2008， 149（1）： 380-388.
[17]尹梅，高海青，李保应，等. 通心络对糖尿病大鼠心肌RAGE、NF-κB 的影响[J]. 山东大学学报：医学版， 2011， 49（8）： 16-20.
[18]S Chen， Z A Khan， M Cukiernik，et al.“Differential activation of NF-κB and AP-1 in increased fibronectin synthesis in target organs of diabetic complications” [J]. American Journal of Physiology， 2003， 284（6）： E1089-E1097.
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[20]Yoshikawa T， Miyazaki A， Fujimoto S. Decrease in serum levels of advanced glycation end-products by short-term lifestyle modification in non-diabetic middle-aged females[J]. Med Sci Monit， 2009， 15（6）： 65-73.
[21]Boor P， Celec P， Behuliak M，et al.Regular moderate exercise reduces advanced glycation and ameliorates early diabetic nephropathy in obese Zucker rats[J]. Metabolism， 2009， 58（11）： 1669-1677.
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