122. 建立RDPCR技术检测p53基因的DNA损伤

来源 :癌变·畸变·突变 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yangmingli1213
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目的:设计、建立并初步评价能检测特定基因DNA损伤的随机末端连接物依赖的PCR(Randomized Terminal Linker-Dependent PCR,RDPCR)新技术。方法:培养TK6细胞并提取基因组DNA。用PCR技术扩增186bp的p53基因外显子7,以凝胶回收纯化的扩增产物为模板,再进行新的PCR反应标记地高辛探针,标记探针被电泳和定量。用限制性内切酶AfaI完全消化基因组DNA建立损伤模型;经过p53基因外显子7的特异性引物P1重复直线延伸,与一带有3′随机粘性末端的双链公共连接物(Linker)在T4 DNA连接酶作用下连接后,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR指数扩增;琼脂糖电泳,真空转印至带正电荷的尼龙膜上,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果:p53基因外显子7的扩增条带清晰,特异。标记探针的电泳速度稍慢于未标记片段;定量为50 μg/μl。RDPCR结果表明,使用3′末端阻止的Linker可见在相应位置出现了清晰的目标带,而未阻止的由于Linker的自身连接显色信号微弱;灰度计量显示RDPCR的信号强度是传统的连接介导聚合酶链反应(Ligation-mediated Polymerase Chain Reaction,LMPCR)的7倍,但其背景稍高。结论:RDPCR是在LMPCR、单链连接PCR(Single-strand Ligation PCR,SLPCR)和末端转移酶依赖的PCR (Terminal transferase-dependent PCR,TDPCR)技术上设计的新的体外扩增技术,可以有效检测特定基因的DNA损伤。它可能克服LMPCR、SLPCR和TDPCR各自的缺陷,如应用局限、连接效率低和定位不精确等,更为灵敏、简便、快速和适用。结合Maxam-Gilbert化学测序技术,RDPCR还能在核酸序列水平检测特定基因的DNA损伤,包括DNA加合物、链断裂和氧化损伤等,有很好的应用前景。
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