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[摘要]：红细胞葡萄糖～6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是一种伴性不完全显性红细胞酶缺陷病，男性半合子和女性纯合子均表现显著缺乏，女生杂合子临床表现不一，有些表现正常，有些表现显著缺乏。本文就当前G6PD缺乏症的分子机制和实验室检测方法的研究进展进行综述，对实验室选择有效和准确的检测方法提供参考。
[中图分类号]R730.43 [文献标识码]A [文章编号]2107-2306（2020）04-246-02
1.引言
G6PD缺乏症分布世界各地，高发区为地中海沿岸国家及东南亚地区。在我国，此病主要好发于南方地区，有南高北低特点。本病是由于G6PD基因突变所致。G6PD基因位于X染色体上，男性半合子和女性纯合子匀表现为G6PD活性缺乏显著，而女性杂合子发病与否，取决于其G6PD缺乏的细胞数量在红细胞群中所占的比例，在临床上有不同的表现，可以表现正常，中度缺乏或显著缺乏;女性杂合子表型的复杂性曾加了杂合子确诊的难度，国内外学者围绕着提高女性杂合子的检出率作了很多的研究工作，提出了一些新的方法，目前研究出简单而又能提高杂合子检出率的检测法，是临床实践迫切需要的方法。
2.发病机制
C6PD缺乏患者服用氧化性药物诱发溶血的机制，目前认为：G6PD在磷酸戊糖旁路代谢中是6-磷酸葡萄糖（G-6-P）轉变为6-磷酸葡萄糖酸（G-6-PD）反应中必需的酶。G6PD缺乏时，使还原三磷酸吡啶核苷（NADPH）减少，不能维持生理浓度的还原型谷胱苷肽（GSH），从而使红细胞膜蛋白中的硫基遭受氧化，破坏了红细胞膜的完整性。NADPH减少后，使高铁血红蛋白（MHb）不能转变为氧合血红蛋白，MHb增加导致红细胞内不可溶性变性珠蛋白小体（Heinzbody）形成增加，红细胞膜变硬，通过脾脏时被破坏，导致溶血。
3.G6PD缺乏症分子机制
G6PD基因位于X染色体长臂2区8带（Xp28），全长约18.5kb，由13个外显子和12个内含子组成，编码515个氨基酸。女性有两条X染色体，故有两个G6PD基因，两条X染色体上G6PD基因都缺乏为纯合子，表现为显著缺乏;只有一条染色体上G6PD基因缺乏为杂合子，临床表现不一。按Lyou理论，两条X染色体中只有一条在遗传上是有活性的，其中一条处于失活状态，而失活是随机的，某一细胞的一条染色体一旦失活，这个细胞的所有后代细胞中的该条X染色体均处于失活状态"。故女性G6PD缺乏杂合子，其G6PD酶活性并不是在RBC内平均分配，而是一群RBC拥有正常G6PD酶活性，另一群RBC则G6PD酶活性缺乏"。理论上，这两组RBC的数量比例应该是l：1，使得RBC总体酶水平为正常人的1/2，即属于中度缺乏状态。但不少学者认为，这两组RBC.的比例在不同个体并不保持1：1比例，这就使G6PD缺乏杂合子在临床上有不同的表现度，表型可以正常，中度缺乏或显著缺乏。故称为不完全显性遗传。男性只有一条X染色体，缺乏者为伴合子，表现为显著缺乏。
4.G6PD缺乏实验室筛查方法
4.1定性检测方法
4.1.1高铁血红蛋白还原试验
正常还原率>0.75;中间型为0.74～0.31;显著缺乏为<0.30。此方法操作简便快捷，缺点是：特异性差，存在假阳性和假阴性，结果为弱阳性时，判断容易出现主观误判，会出现模凌两可情况，且溶血标本会对结果造成影响，该方法用于新生儿筛查时假阳性偏高[3]。优点是：不需要昂贵的试剂或仪器，操作简便，可用于普查。
4.1.2荧光斑点试验
G6PD活性正常者10分钟内出现荧光，中间型10～30分钟出现荧光，严重缺乏30分钟仍不出现荧光。荧光斑点法优点是：敏感性和特异性较高;缺点是：操作不够快捷。
4.1.3硝基四氮唑蓝纸片法（NBT法）
G6PD活性正常者滤纸片呈紫蓝色，中间型呈淡蓝色，显著缺乏者呈红色。此方法简便快捷，可以检测出部分杂合子，但特异性较差响。尽管NBT纸片定性法也有过高假阳性的特点，但由于其简便的特点，容易在基层推广
4.1.4G6PD/6GPD比值法
C6PD/6GPD<1.00为缺乏，G6PD/6GPD>1.00为正常。
4.2.1NBT定量法：其正常值为13.1～30.0BNT单位
4.2.2G6PD/6PGD比值定量法：通常应用的有两种方法，一是按WHO推荐的Zinkham法，同时测定G6PD活性和6PCD活性，计算G6PD/6PGD比值;二二是分别以6PG和G6P作为底物，用NBT定量法分别测定G6PD活性和6PGD的活性，计算G6PD/6PGD比值。其正常值为：WHO推荐法：G6PD/6PGD>0.95;NBT法：G6PD/6PGD>0.98（新生儿》1.09）。G6PD/6PGD比值可以进一步提高杂合子的检出率"。是目前检测G6PD酶活性缺乏较为理想的方法。
4.2.3G6PD酶活性测定法（速率法）：抗凝血离心取红细胞层20ul于含有Iml溶血剂试管里，待红细胞溶解后立即上生化仪检测（注：红细胞溶解到上机时间约8分钟，最长必须在25分钟内完成）G6PD活性单位为U/L，<1300U/L为缺乏，>3600为增高，介于二者之间为正常，G6PD酶活性测定是通过单位时间生成NADPH的量来反映红细胞G6PD的活性。该方法检出率没有比值法高，但速率法可以在自动生化分析仪上重复检测，重复性测量避免误差是其他方法所没有的。
4.3几点结论
以上是目前临床常用于G6PD酶缺乏检测的方法，基本原理都是直接或间接检测G6PD酶的活性。虽然由定性向定量不断改进，但是对杂合子检出效果还是较差"-10，1991年由杜传书教授提出的比值法，在其小样本试验中杂合子检出率可达69.1%"，漏检率31.9%;胡淑芬等采用从G6PD缺乏男婴追溯其母亲酶缺乏报道的漏检率33.3%”。鉴于传统方法对杂合子检出难度大，漏检率高，国内外学者在杂合子检测方法上做了很多探讨，基于G6PD缺乏症发生的分子机制和分子生物学技术在医学领域的广泛应用和迅速发展，G6PD缺乏症的研究进人基因检测时代。 5.基因检测
5.1对已知G6PD基因突变位点筛查的方法
5.1.1位点特异性寡核苷酸探针杂交法（ASO）。该法简单易行，但杂交和洗脱条件控制不好时，经常出现假阴性或假阳性，且需要同位素。
5.1.2台湾张建国等建立的错配PCR/RE酶切法。该法特异性很高，但方法繁琐，有些限制性切酶较昂贵，最重要的是常出现酶切不完全现象。
5.1.3突变特异性扩增系统（ARMS）。此法简便、快速、准确、经济，一次PCR即可检出结果。但此法对引物设计要求高，各突变位点需要进行各自PCR反应，不能同时检测多个位点。
5.1.4高分辩率熔解曲线法（HRM）。HRM是近年发展起来的一种简便、快速、高通量、价廉的基因突变筛查检测技术"，是犹他大学和爱德华科技公司于2000年合作开发出的一项新的突变/SNP检测分析技术"。HRM可以准确地检测己知突变位点，又可以发现新突变位点及多态性，自动化程度高。不足之处是对于G6PD缺乏症基因型分布及揭示地区人群起源和迁徙有明显不足，对PCR反应、熔解仪器、荧光染料要求较高，突变扫描不能精确区分扩增片段中不同杂合突变”。
5.1.5多重SNaPshot基因分型技术，也称微测序。此方法结果清析直观，易于判读，对扩增产物进行各位点微测序，准确性及特异与金標准测序相当"，且成本低，操作简单快捷，自动化程度高。不足之处：检测需要特殊设备且设备昂贵
5.1.6PCR+导流杂交技术。该方法通过对血液进行DNA提取及扩增，最后对扩增产物进行导流杂交达到基因分型的目的，能同时检测14突变，覆盖中国人群90%以上常见突变位点，操作简便，便于扩容，能准确区分杂合与纯合突变"。
5.1.7荧光定量PCR检测法。该方法有快速、简单、价格低廉、准确可靠、可提高杂合子检出率、的特点[18]，适合临床筛查。该方法通过扩增曲线的“有”“无”确定样本是否有突变，根据荧光曲线的颜色判定突变点信息。该方法局限性：受到引物和特异识别探针设计的局限性，只能检测复盖中国人群常见的突变位点，对稀有突变会漏检。
5.2对未知突变的筛查方法
5.2.1单链构象多态性分析法（sSCP）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）
SSCP和DGGE可以筛选出可能发生变异的外显子，然后通过测序确定变异的碱基，但sSCP和DGGE各种实验条件的变化对实验结果影响大，目前尚无法根据已知序列来预测某一片段的最适条件，故敏感度低，少见或新的变异漏检率高。
5.2.2变性高效液相色谱法（DHPLC）四。此法特异性和敏感性均高于前两者，且重复性较好，可在常规半变性条件下用于筛查DNA片段中的未知突变外，还具备在完全变形条件下分离长度仅相差一个碱基的短片段单链及长度相等仅有一个碱基不同的DNA或RNA的性能。
5.2.3DNA测序法。是检测基因突变的金标准。检测成本高，一般用于科研。
6.结语
G6PD酶缺乏的实验室检测从开始的直接或间接对酶活性检测到基因检测，最后到DNA直接测序。酶学检测法对女性杂合子漏检率高，基因检测法虽然提高了杂合子的检出率，但对稀有突变和未知突变存在漏检，DNA测序法是金标准，但检测成本高，目前一般用于科研。简单而准确的检测G6PD缺乏症，且适合大规模筛查和临床使用的检测方法仍然是临床实践中迫切需要的方法。随着分子生物学技术在医学检验的迅速发展，给G6PD缺乏症的分子诊断带来了突飞猛进的变化。每种分子诊断方法各有其优缺点，各实验室可根据具体情况，选择适合的诊断方法，对于女性患者，筛查时优先采用分子诊断技术可减少大量病例漏诊[20]。
参考文献
[1]Lyou MF .Gene action in the X一chromosome of the mouse （MusmusculusI）.Nature， 1961;190（4773）;372-373.
[2]BeutlerF.Yeh M Fairbanks VF.The normal human femaleas amosajc of X-chromosome activity studies using thegene for G6PDdeficiency as a marker Proceedings of the national a acac deny of sciencs of the united states of anerica， 1962;48：9-16.
[3]姚英姿，谭志伟，杨孜，等。新生儿G6PD缺乏症筛查结果分析]中国妇幼保健，2008，23（4）498-500.
[4]吴瑞萍，胡亚美等实用儿科学[M].第6版.北京：人民卫生出版社，1996：1709-1715.
[5]Tchemichko D，Lamorit J，Pov H，et al.Evaluation of mutationscreeningbyheterduplx analysisinacuteintermi ttentporphyriacomparison with denaturing gradient gel eletrophoresis[J].Clin Chin Acta 1999，879（1-2）：133-143.
[6]张晓莉，府伟灵.基因突变筛选检测技术即国外医疗，临床生物化学与检验学册，2002，23（1）;13-14.
[7]王卫平，毛萌等.儿科学[M].第8版.北京.人民卫生出版社，2013：360-363.
[8]Zaffanello M，Rugolottos，Zanboni G，et al.Neunatal Screening for glucose6-Phos phate dehydrogenase deficiency fails to detectherozy gote females.Eropean joumal of epidemiology，2004; 19 （3）： 255-257. [9]许延康，吴秋玲，芮琳，等.对红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的几种筛选方法的评价中山医学院学报，1980，1（2）：177-181.
[10]Tagarelli A，Piro A，Bastone I，et al.Reliability of quantitative andquantitative tests to identify heterozygotescarrying sever or mild G6PDdeficiency.Clinical biochemistry .2005;39（2）：183-186.
[11]杜传书.红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症检测的G6PD/6PGD比值法.优生与遗传.1991：1（4）：1-3.
[12]胡淑分，罗韬.从G6PD缺乏男婴追溯母亲酶缺陷的漏检情况[J].中国优生与遗传杂志，2013.21（5）：78-79.
[l3]Marotta R V，Turri O，Morandi A，et al.High restution melting analysis to genotype the most common V ariants in the HFE gene[J ].Clin Chem Lab Med，2011 ，49（9）：1453-1457.
[14]Wittwer C T，Keed G H，Gundry C N ，et al.High-resolutiongenotyping by amplicon melting analysis usingL C Green[J].ClinChem ，2003，49（6 Pt1）：853-860.
[15]潘美晨，蔡應木.G6PD缺乏症基因型检测新方法的建立及分子流行特征分析[J]分子诊断与治疗杂志，2012，4（4）：222-226.
[16]吴彤华，成金泉，等G6PD缺乏症单细胞SNaPshot基因诊断方法建立[J]生殖医学杂志，2015，04，304-310.
[17]赵颖，巫静帆，等。东莞地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因突变筛查[J]中华医学遗传学杂志，2018，35（6）840-843.
[18]李维张静，等荧光PCR基因检测对G6PD缺乏症的诊断价值探讨[J]中国优生与遗传杂志，2017，25（4），19-22.
[19]罗建明，李慕军，唐霞等.变性高效液相联合测序及酶切检测广西葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因型[J].中华血液学杂志，2005;26（10）：607-611.
[20]李磊，郭洪创，等逆遗传方向研究男性G6PD缺乏症及其母亲的表型与基因型[J]中国生育健康杂志，2019，03：232-236.
通迅作者：韦小荣，副主任技师，2951025534@163.com
[中图分类号]R730.43 [文献标识码]A [文章编号]2107-2306（2020）04-246-02
1.引言
G6PD缺乏症分布世界各地，高发区为地中海沿岸国家及东南亚地区。在我国，此病主要好发于南方地区，有南高北低特点。本病是由于G6PD基因突变所致。G6PD基因位于X染色体上，男性半合子和女性纯合子匀表现为G6PD活性缺乏显著，而女性杂合子发病与否，取决于其G6PD缺乏的细胞数量在红细胞群中所占的比例，在临床上有不同的表现，可以表现正常，中度缺乏或显著缺乏;女性杂合子表型的复杂性曾加了杂合子确诊的难度，国内外学者围绕着提高女性杂合子的检出率作了很多的研究工作，提出了一些新的方法，目前研究出简单而又能提高杂合子检出率的检测法，是临床实践迫切需要的方法。
2.发病机制
C6PD缺乏患者服用氧化性药物诱发溶血的机制，目前认为：G6PD在磷酸戊糖旁路代谢中是6-磷酸葡萄糖（G-6-P）轉变为6-磷酸葡萄糖酸（G-6-PD）反应中必需的酶。G6PD缺乏时，使还原三磷酸吡啶核苷（NADPH）减少，不能维持生理浓度的还原型谷胱苷肽（GSH），从而使红细胞膜蛋白中的硫基遭受氧化，破坏了红细胞膜的完整性。NADPH减少后，使高铁血红蛋白（MHb）不能转变为氧合血红蛋白，MHb增加导致红细胞内不可溶性变性珠蛋白小体（Heinzbody）形成增加，红细胞膜变硬，通过脾脏时被破坏，导致溶血。
3.G6PD缺乏症分子机制
G6PD基因位于X染色体长臂2区8带（Xp28），全长约18.5kb，由13个外显子和12个内含子组成，编码515个氨基酸。女性有两条X染色体，故有两个G6PD基因，两条X染色体上G6PD基因都缺乏为纯合子，表现为显著缺乏;只有一条染色体上G6PD基因缺乏为杂合子，临床表现不一。按Lyou理论，两条X染色体中只有一条在遗传上是有活性的，其中一条处于失活状态，而失活是随机的，某一细胞的一条染色体一旦失活，这个细胞的所有后代细胞中的该条X染色体均处于失活状态"。故女性G6PD缺乏杂合子，其G6PD酶活性并不是在RBC内平均分配，而是一群RBC拥有正常G6PD酶活性，另一群RBC则G6PD酶活性缺乏"。理论上，这两组RBC的数量比例应该是l：1，使得RBC总体酶水平为正常人的1/2，即属于中度缺乏状态。但不少学者认为，这两组RBC.的比例在不同个体并不保持1：1比例，这就使G6PD缺乏杂合子在临床上有不同的表现度，表型可以正常，中度缺乏或显著缺乏。故称为不完全显性遗传。男性只有一条X染色体，缺乏者为伴合子，表现为显著缺乏。
4.G6PD缺乏实验室筛查方法
4.1定性检测方法
4.1.1高铁血红蛋白还原试验
正常还原率>0.75;中间型为0.74～0.31;显著缺乏为<0.30。此方法操作简便快捷，缺点是：特异性差，存在假阳性和假阴性，结果为弱阳性时，判断容易出现主观误判，会出现模凌两可情况，且溶血标本会对结果造成影响，该方法用于新生儿筛查时假阳性偏高[3]。优点是：不需要昂贵的试剂或仪器，操作简便，可用于普查。
4.1.2荧光斑点试验
G6PD活性正常者10分钟内出现荧光，中间型10～30分钟出现荧光，严重缺乏30分钟仍不出现荧光。荧光斑点法优点是：敏感性和特异性较高;缺点是：操作不够快捷。
4.1.3硝基四氮唑蓝纸片法（NBT法）
G6PD活性正常者滤纸片呈紫蓝色，中间型呈淡蓝色，显著缺乏者呈红色。此方法简便快捷，可以检测出部分杂合子，但特异性较差响。尽管NBT纸片定性法也有过高假阳性的特点，但由于其简便的特点，容易在基层推广
4.1.4G6PD/6GPD比值法
C6PD/6GPD<1.00为缺乏，G6PD/6GPD>1.00为正常。
4.2.1NBT定量法：其正常值为13.1～30.0BNT单位
4.2.2G6PD/6PGD比值定量法：通常应用的有两种方法，一是按WHO推荐的Zinkham法，同时测定G6PD活性和6PCD活性，计算G6PD/6PGD比值;二二是分别以6PG和G6P作为底物，用NBT定量法分别测定G6PD活性和6PGD的活性，计算G6PD/6PGD比值。其正常值为：WHO推荐法：G6PD/6PGD>0.95;NBT法：G6PD/6PGD>0.98（新生儿》1.09）。G6PD/6PGD比值可以进一步提高杂合子的检出率"。是目前检测G6PD酶活性缺乏较为理想的方法。
4.2.3G6PD酶活性测定法（速率法）：抗凝血离心取红细胞层20ul于含有Iml溶血剂试管里，待红细胞溶解后立即上生化仪检测（注：红细胞溶解到上机时间约8分钟，最长必须在25分钟内完成）G6PD活性单位为U/L，<1300U/L为缺乏，>3600为增高，介于二者之间为正常，G6PD酶活性测定是通过单位时间生成NADPH的量来反映红细胞G6PD的活性。该方法检出率没有比值法高，但速率法可以在自动生化分析仪上重复检测，重复性测量避免误差是其他方法所没有的。
4.3几点结论
以上是目前临床常用于G6PD酶缺乏检测的方法，基本原理都是直接或间接检测G6PD酶的活性。虽然由定性向定量不断改进，但是对杂合子检出效果还是较差"-10，1991年由杜传书教授提出的比值法，在其小样本试验中杂合子检出率可达69.1%"，漏检率31.9%;胡淑芬等采用从G6PD缺乏男婴追溯其母亲酶缺乏报道的漏检率33.3%”。鉴于传统方法对杂合子检出难度大，漏检率高，国内外学者在杂合子检测方法上做了很多探讨，基于G6PD缺乏症发生的分子机制和分子生物学技术在医学领域的广泛应用和迅速发展，G6PD缺乏症的研究进人基因检测时代。 5.基因检测
5.1对已知G6PD基因突变位点筛查的方法
5.1.1位点特异性寡核苷酸探针杂交法（ASO）。该法简单易行，但杂交和洗脱条件控制不好时，经常出现假阴性或假阳性，且需要同位素。
5.1.2台湾张建国等建立的错配PCR/RE酶切法。该法特异性很高，但方法繁琐，有些限制性切酶较昂贵，最重要的是常出现酶切不完全现象。
5.1.3突变特异性扩增系统（ARMS）。此法简便、快速、准确、经济，一次PCR即可检出结果。但此法对引物设计要求高，各突变位点需要进行各自PCR反应，不能同时检测多个位点。
5.1.4高分辩率熔解曲线法（HRM）。HRM是近年发展起来的一种简便、快速、高通量、价廉的基因突变筛查检测技术"，是犹他大学和爱德华科技公司于2000年合作开发出的一项新的突变/SNP检测分析技术"。HRM可以准确地检测己知突变位点，又可以发现新突变位点及多态性，自动化程度高。不足之处是对于G6PD缺乏症基因型分布及揭示地区人群起源和迁徙有明显不足，对PCR反应、熔解仪器、荧光染料要求较高，突变扫描不能精确区分扩增片段中不同杂合突变”。
5.1.5多重SNaPshot基因分型技术，也称微测序。此方法结果清析直观，易于判读，对扩增产物进行各位点微测序，准确性及特异与金標准测序相当"，且成本低，操作简单快捷，自动化程度高。不足之处：检测需要特殊设备且设备昂贵
5.1.6PCR+导流杂交技术。该方法通过对血液进行DNA提取及扩增，最后对扩增产物进行导流杂交达到基因分型的目的，能同时检测14突变，覆盖中国人群90%以上常见突变位点，操作简便，便于扩容，能准确区分杂合与纯合突变"。
5.1.7荧光定量PCR检测法。该方法有快速、简单、价格低廉、准确可靠、可提高杂合子检出率、的特点[18]，适合临床筛查。该方法通过扩增曲线的“有”“无”确定样本是否有突变，根据荧光曲线的颜色判定突变点信息。该方法局限性：受到引物和特异识别探针设计的局限性，只能检测复盖中国人群常见的突变位点，对稀有突变会漏检。
5.2对未知突变的筛查方法
5.2.1单链构象多态性分析法（sSCP）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）
SSCP和DGGE可以筛选出可能发生变异的外显子，然后通过测序确定变异的碱基，但sSCP和DGGE各种实验条件的变化对实验结果影响大，目前尚无法根据已知序列来预测某一片段的最适条件，故敏感度低，少见或新的变异漏检率高。
5.2.2变性高效液相色谱法（DHPLC）四。此法特异性和敏感性均高于前两者，且重复性较好，可在常规半变性条件下用于筛查DNA片段中的未知突变外，还具备在完全变形条件下分离长度仅相差一个碱基的短片段单链及长度相等仅有一个碱基不同的DNA或RNA的性能。
5.2.3DNA测序法。是检测基因突变的金标准。检测成本高，一般用于科研。
6.结语
G6PD酶缺乏的实验室检测从开始的直接或间接对酶活性检测到基因检测，最后到DNA直接测序。酶学检测法对女性杂合子漏检率高，基因检测法虽然提高了杂合子的检出率，但对稀有突变和未知突变存在漏检，DNA测序法是金标准，但检测成本高，目前一般用于科研。简单而准确的检测G6PD缺乏症，且适合大规模筛查和临床使用的检测方法仍然是临床实践中迫切需要的方法。随着分子生物学技术在医学检验的迅速发展，给G6PD缺乏症的分子诊断带来了突飞猛进的变化。每种分子诊断方法各有其优缺点，各实验室可根据具体情况，选择适合的诊断方法，对于女性患者，筛查时优先采用分子诊断技术可减少大量病例漏诊[20]。
参考文献
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[10]Tagarelli A，Piro A，Bastone I，et al.Reliability of quantitative andquantitative tests to identify heterozygotescarrying sever or mild G6PDdeficiency.Clinical biochemistry .2005;39（2）：183-186.
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[l3]Marotta R V，Turri O，Morandi A，et al.High restution melting analysis to genotype the most common V ariants in the HFE gene[J ].Clin Chem Lab Med，2011 ，49（9）：1453-1457.
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[16]吴彤华，成金泉，等G6PD缺乏症单细胞SNaPshot基因诊断方法建立[J]生殖医学杂志，2015，04，304-310.
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通迅作者：韦小荣，副主任技师，2951025534@163.com