【摘 要】
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目的构建稳定高表达芳香烃受体(AhR)的小鼠RAW264.7细胞株,观察AhR对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞炎症细胞因子表达的影响。方法构建含AhR-Flag-EGFP基因的慢病毒重组质粒
【机 构】
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第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室,重庆医科大学附属第一医院检验科,
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目的构建稳定高表达芳香烃受体(AhR)的小鼠RAW264.7细胞株,观察AhR对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞炎症细胞因子表达的影响。方法构建含AhR-Flag-EGFP基因的慢病毒重组质粒载体并获得病毒上清,感染RAW264.7细胞后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达的单克隆细胞株,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达情况,qRT-PCR和Western blot法验证AhR基因及蛋白水平表达情况。qRT-PCR和ELISA检测LPS刺激后炎症细胞因子的表达情况。结果获得1株稳定高表达AhR的RAW264.7细胞,荧光显微镜和流式细胞仪显示其荧光率达100%,qRT-PCR和Western blot结果表明RAW/AhR稳转组相对于RAW/Vector空转组,AhR的m RNA和蛋白水平明显上调(P<0.05)。LPS刺激后炎症相关细胞因子表达升高,相对于空转组,稳转组的促炎细胞因子IL-6、IL-1β的表达更低(P<0.05),抗炎细胞因子IL-10的表达更高(P<0.05)。结论成功构建稳定表达AhR的RAW264.7单克隆细胞株,证实了AhR对LPS刺激的巨噬细胞炎症反应具有负性调控作用,为后续进一步研究巨噬细胞中AhR的免疫调节及其他功能奠定基础。
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