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摘 要：以青花菜中青9号品种为试材，从灭酶处理、干燥处理和提取条件3个方面对青花菜花球中总硫代葡萄糖苷提取工艺进行优化。运用氯化钯分光光度法，比较分析经过不同处理后的青花菜花球总硫代葡萄糖苷含量，以期筛选出总硫苷提取的最佳工艺。结果表明，不同处理对青花菜花球中总硫代葡萄糖苷含量的影响有一定差异。加入100 ℃蒸馏水后80 ℃热处理15 min的灭酶处理，70 ℃鼓风干燥，乙醇浓度90%、料液比1∶9、提取温度60 ℃、提取时间30 min的提取条件下测得青花菜花球中总硫苷含量（b）最高，为414.98 μmol·g-1，此处理为青花菜花球中总硫苷提取最佳工艺。
关键词：青花菜;总硫代葡萄糖苷;提取工艺;优化
中图分类号：S635 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）04-062-06
Abstract： In this study， the extraction process of total glucosinolates from broccoli was optimized from three aspects： enzyme-inactivation， drying and grinding， and extraction condition， and the broccoli variety Zhongqing 9 hao was used as material in this study. In order to screen out the best extraction process of total glucosinolates， the total glucosinalates contents of broccoli with different treatments were compared and analyzed by palladium chloride-spectrophotometer. The results showed that the effects of different treatments on the total glucosinolates contents of brocolli were significantly different. Under the conditions of 100 ℃ distilled water， 80 ℃ heat treatment for 15 min， 70 ℃ air drying， 90% ethanol concentration， 1：9 ratio of solid to liquid， 60 ℃ extraction temperature and 30 min extraction time， the content of total glucosinolates in broccoli was the highest （414.98 μmol·g-1）， which was the best extraction process of total glucosinolates from broccoli.
Key words： Broccoli; Total glucosinolates; Extraction process; Optimization
青花菜（Brassica oleracea var. italica）又名绿花菜，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种[1]。青花菜营养物质丰富，主要含有蛋白质、脂肪、膳食纤维、糖类、胡萝卜素和维生素，并且含有丰富的矿物质，被称为高营养蔬菜[2-3]。研究表明，青花菜中硫代葡萄糖苷含量丰富，虽然总含量在同科蔬菜中并不是最高，但具有明显抗癌生物活性的萝卜硫素含量很高[4-6]。
硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GLs，简称硫苷）是一种含硫的植物次级代谢产物，在十字花科蔬菜中种类和含量最丰富，目前已发现120多种[7]。富含硫苷的食物具有特殊风味和保健作用，这与硫苷的降解产物有关，其降解产物在抗菌抑虫、引发生物抗癌抑癌等方面具有重要的作用[6]。研究表明，当植物中含有硫代葡萄糖苷的同时，也含有降解硫代葡萄糖苷的酶类，这种酶就是黑芥子酶[8]。当植物器官被切碎或咀嚼时，硫代葡萄糖苷会与植物内部的黑芥子酶发生酶解反应，使硫代葡萄糖苷水解，从而产生异硫氰酸、腈等一些对人类有害的物质[9]。此外当外界环境有所改变时硫苷也会有一定的非降解反应[10]。
目前已有的总硫苷含量检验方法主要有BaSO4重量法、近红外光谱法、高效液相色谱法、氣相色谱法等[11-13]。本试验采用氯化钯法对总硫苷含量进行测量，该方法具有操作简单、准确、快速等优点，只要保证测量时所需的温度时间等条件即可，其原理是钯离子与硫代葡萄糖苷生成一种有色络合物，再利用紫外分光光度计进行吸光值的测量[13]。
近几年，对硫苷的研究多为对其单体结构的鉴定分析，对提取工艺的研究较少[14]。不同研究者对青花菜硫苷提取工艺进行了优化，李宁[6]通过单因素试验得到西兰花干硫苷的最佳提取工艺：90%乙醇作为提取剂，料液比1∶11，提取时间为1 h，重复提取4次，得到硫苷纯度为15.22 mg·g-1;贾治勇等[15]通过单因素和正交试验，得到西兰花茎中提取硫苷的最佳工艺条件为：乙醇浓度75%、料液比为1∶15、提取温度为70 ℃、提取时间为30 min，在此条件下提取物中硫苷的提取质量摩尔浓度为601.24 μmol·g-1;邓艳美等[16]通过单因素和正交试验，得到青花菜干粉中提取硫苷的最佳条件为乙醇浓度75%、料液比为1∶7、提取温度80 ℃、提取时间为20 min，提取液中硫代葡萄糖苷质量摩尔浓度达到33.71 μmol·g-1。不同研究者得到的结果不同，笔者通过对青花菜花球中总硫苷的提取工艺的研究，提高其利用率，尤其在抗癌抑癌方面，旨在为人类健康做一些贡献，也为后续硫代葡萄糖苷的相关研究提供了一定的理论支撑。 2.2 不同干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响
由图3可以得出，不同干燥处理对青花菜花球总硫苷含量的影响不同。其中冷冻干燥处理青花菜花球测得的总硫苷含量最低;70 ℃鼓风干燥处理青花菜花球测得的总硫苷含量最高;微波干燥处理梯度间差异相对于鼓风干燥处理梯度间差异较大，微波干燥处理下测得青花菜总硫苷含量（b，后同）最大值和最小值相差34.92 μmol·g-1，而鼓风干燥处理下测得青花菜总硫苷含量最大值和最小值相差30.48 μmol·g-1。
2.2.1 微波干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响 在微波干燥处理中，微波中高火处理条件下青花菜总硫苷含量显著高于其他火力处理;除微波中火处理外，微波低火处理条件下青花菜总硫苷含量显著低于其他火力處理;微波低火与微波中火、微波中低火与微波中火、微波中低火与微波高火间均没有显著性差异。
2.2.2 鼓风干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响 在鼓风干燥处理中，鼓风干燥70 ℃显著高于其他鼓风干燥处理;除鼓风干燥60 ℃外，鼓风干燥50 ℃和鼓风干燥100℃显著低于其他鼓风干燥处理;鼓风干燥50 ℃、60 ℃和100 ℃没有显著性差异;鼓风干燥60 ℃和鼓风干燥80 ℃没有显著性差异;鼓风干燥80 ℃和鼓风干燥90 ℃没有显著性差异。
2.3 不同提取条件对青花菜总硫苷含量的影响
由表3可知，不同提取方式对青花菜总硫苷含量的影响不同。在乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度有差异时，青花菜中提取到的总硫苷含量也有差异。在25个处理中，在A1B0C0D4、A3B2C3D4、A0B0C3D3 处理下所提取出来的青花菜花球总硫苷含量分别为414.98、391.03、323.92 μmol·g-1，均显著高于其他处理所提取出来的总硫苷含量。而在A0B3C2D0、A1B3C3D1、A2B3C3D0、A3B3C0D1处理下所提取出来的青花菜总硫苷的量均显著低于其他处理，且提取出的总硫苷含量都低于在100 μmol·g-1，且这4组的温度都为90 ℃，表明提取温度90 ℃太高会影响硫苷含量的提取。乙醇浓度90%、料液比为1∶9、提取温度60 ℃、提取时间为30 min提取得到的总硫苷含量最高。
3 讨论与结论
在最近几年中，硫苷的提取鉴定引起了研究人员的极大兴趣。在《青花菜抗癌原理被发现》[19]一文中，青花菜的抗癌功效被证实，越来越多的人开始关注青花菜。沈莲清等[20]通过对西兰花种子中的硫苷进行了提取，验证了萝卜硫素对5种肿瘤细胞株均有显著的体外增殖抑制活性。黑芥子酶是降解硫苷的主要酶源，因此成为了抗癌研究的新方向[19]，丁艳等[22]通过对油菜籽饼粕中硫苷的酶解条件优化的研究，表明了黑芥子酶在不同条件下对硫苷的降解产物生成量存在差异。因此，想要在植物中提取高含量的硫苷，首先应该进行灭酶处理，以防硫苷酶解生成其他有害物质。
本试验研究结果表明，不同灭酶处理提取出的总硫苷含量存在差异，以100 ℃蒸馏水热处理提取效果最好。其中，试剂不同，相同处理方式提取的总硫苷含量不同，100 ℃蒸馏水提取的硫苷含量比75 ℃95%乙醇提取的总硫苷含量要高;相同的试剂，不同的灭酶处理方式提取的总硫苷含量也不同，100 ℃蒸馏水热处理提取硫苷含量显著高于微波处理提取总硫苷含量，75 ℃95%乙醇微波处理提取的总硫苷含量要高于热处理。
韩梦凡[23]研究表明结球甘蓝在干燥过程中显著抑制硫苷成分的降解，减少了有害产物的生成量，表明干燥处理对硫苷含量的提取有影响。本试验结果表明，鼓风干燥条件下，温度为50 ℃、60 ℃时干燥较慢，时间略长，使硫苷在干燥过程中发生降解，虽然80 ℃、90 ℃、100 ℃时青花菜花球水分散失较快，但高温还会使硫苷发生降解，所以70 ℃时干燥处理效果最好。相对于鼓风干燥而言，微波干燥迅速，时间短，并且受热均匀，火力中高火时效果最好，但为了防止过度受热使硫苷发生降解，需要在干燥过程中多次测量散失水分的质量，可能导致所需火力不能一直保持，增加了干燥时间，使得硫苷发生了降解。
李宁[6]在西兰花干硫苷的提取中，发现提取硫苷最佳的工艺条件为乙醇浓度为70%、料液比1∶10、提取温度80 ℃、提取时间为40 min;贾治勇等[15]在西兰花茎中硫苷的提取工艺研究中发现提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度75%、料液比1∶9、提取温度70 ℃、提取时间30 min;邓艳美[16]在青花菜硫代葡萄糖苷的提取工艺中发现提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度75%、料液比1∶7、提取温度80 ℃、提取时间30 min。本试验结果表明，提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度90%、料液比1∶9、提取温度60 ℃、提取时间30 min，其中最佳提取时间和料液比与前人的研究基本保持一致，但乙醇浓度和提取温度有所偏差。本试验最佳提取温度为60 ℃，这与李宁[6]研究得出的随着温度的提高硫苷提取含量增加的结论有差异，可能与试验材料品种等因素有关。本试验提取最佳乙醇浓度为90%，这与贾治勇等[15]研究得出的随着乙醇浓度增大硫苷提取量增大，但在75%达到最大值的结论有差异，可能是与测定的部位等因素有关。
综上所述，加入100 ℃蒸馏水后80 ℃热处理15 min灭酶处理，70 ℃鼓风干燥，乙醇浓度90%、料液比1∶9、提取温度60 ℃、提取时间30 min的提取条件下测得青花菜花球中总硫代葡萄糖苷含量最高，为414.98 μmol·g-1，其为花青菜花球中总硫苷提取的最佳工艺。
参考文献
[1] 李向阳.西兰花[M].广州：广东科技出版社，2001：1-2.
[2] 王晓梅，崔坤，陆艳玲.中国西兰花应用价值及生产、出口前景分析[J].中国农学通报，2008，24（11）：478-480.
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[5] 李志邈，曹家树.蔬菜的抗癌特性[J].北方园艺，2001（4）：4-6.
[6] 李宁.西兰花干硫苷的提取工艺优化及富集纯化研究[D].杭州：浙江工商大学，2015.
[7] 邱海榮.不同品种青花菜和花椰菜硫代葡萄糖苷含量的测定及比较[D].南京：南京农业大学，2008.
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[9] 刘月萍，王向阳.黑芥子酶研究进展[J].生物技术通讯，2006，17（5）：837-839.
[10] 叶珊珊.青花菜中萝卜硫苷的提取及降解产物抑菌活性研究[D].杭州：浙江工商大学，2013.
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[12] 严远鑫，李劲峰，郑树松，等.Ba35 SO4同位素稀释分析法高精密分析菜籽（饼）硫代葡萄糖甙总量的研究[J].作物学报，2002，28（1）：36-41.
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[14] 江敏.萝卜硫苷的分离纯化工艺研究[D].合肥：合肥工业大学，2012.
[15] 贾治勇，张素敏，贾阳希.西兰花茎中硫苷的提取工艺研究[J].山西农业大学学报（自然科学版），2016，36（8）：586-589.
[16] 邓艳美，王红妹，万从庆.青花菜中硫代葡萄糖苷的提取工艺[J].江苏农业科学，2013，41（6）：254-256.
[17] 明道绪.高级生物统计[M].北京：中国农业出版社，2006：187-192.
[18] 王玉顺.试验设计与统计分析SAS实践教程[M].西安：西安电子科技大学出版社，2012：56-57.
[19] 济州.西兰花抗癌原理被发现[J].农产品加工，2011（3）：41.
[20] 沈莲清，苏光耀，王奎武.西兰花种子中硫苷酶解产物萝卜硫素的提纯与抗肿瘤的体外试验研究[J].中国食品学报，2008，8（5）：15-21.
[21] 孙艳伟，张泽生，王田心，等.十字花科植物中黑芥子酶的研究进展[J].食品研究与开发，2017，38（11）：216-220.
[22] 丁艳，李丽倩，曹蓉.油菜籽饼粕中硫苷的酶解条件优化及降解产物分析[J].中国农业科学，2014，47（2）：383-393.
[23] 韩梦凡.鲜切和干燥过程中结球甘蓝品质变化研究[D].南京：南京农业大学，2018.
关键词：青花菜;总硫代葡萄糖苷;提取工艺;优化
中图分类号：S635 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）04-062-06
Abstract： In this study， the extraction process of total glucosinolates from broccoli was optimized from three aspects： enzyme-inactivation， drying and grinding， and extraction condition， and the broccoli variety Zhongqing 9 hao was used as material in this study. In order to screen out the best extraction process of total glucosinolates， the total glucosinalates contents of broccoli with different treatments were compared and analyzed by palladium chloride-spectrophotometer. The results showed that the effects of different treatments on the total glucosinolates contents of brocolli were significantly different. Under the conditions of 100 ℃ distilled water， 80 ℃ heat treatment for 15 min， 70 ℃ air drying， 90% ethanol concentration， 1：9 ratio of solid to liquid， 60 ℃ extraction temperature and 30 min extraction time， the content of total glucosinolates in broccoli was the highest （414.98 μmol·g-1）， which was the best extraction process of total glucosinolates from broccoli.
Key words： Broccoli; Total glucosinolates; Extraction process; Optimization
青花菜（Brassica oleracea var. italica）又名绿花菜，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种[1]。青花菜营养物质丰富，主要含有蛋白质、脂肪、膳食纤维、糖类、胡萝卜素和维生素，并且含有丰富的矿物质，被称为高营养蔬菜[2-3]。研究表明，青花菜中硫代葡萄糖苷含量丰富，虽然总含量在同科蔬菜中并不是最高，但具有明显抗癌生物活性的萝卜硫素含量很高[4-6]。
硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GLs，简称硫苷）是一种含硫的植物次级代谢产物，在十字花科蔬菜中种类和含量最丰富，目前已发现120多种[7]。富含硫苷的食物具有特殊风味和保健作用，这与硫苷的降解产物有关，其降解产物在抗菌抑虫、引发生物抗癌抑癌等方面具有重要的作用[6]。研究表明，当植物中含有硫代葡萄糖苷的同时，也含有降解硫代葡萄糖苷的酶类，这种酶就是黑芥子酶[8]。当植物器官被切碎或咀嚼时，硫代葡萄糖苷会与植物内部的黑芥子酶发生酶解反应，使硫代葡萄糖苷水解，从而产生异硫氰酸、腈等一些对人类有害的物质[9]。此外当外界环境有所改变时硫苷也会有一定的非降解反应[10]。
目前已有的总硫苷含量检验方法主要有BaSO4重量法、近红外光谱法、高效液相色谱法、氣相色谱法等[11-13]。本试验采用氯化钯法对总硫苷含量进行测量，该方法具有操作简单、准确、快速等优点，只要保证测量时所需的温度时间等条件即可，其原理是钯离子与硫代葡萄糖苷生成一种有色络合物，再利用紫外分光光度计进行吸光值的测量[13]。
近几年，对硫苷的研究多为对其单体结构的鉴定分析，对提取工艺的研究较少[14]。不同研究者对青花菜硫苷提取工艺进行了优化，李宁[6]通过单因素试验得到西兰花干硫苷的最佳提取工艺：90%乙醇作为提取剂，料液比1∶11，提取时间为1 h，重复提取4次，得到硫苷纯度为15.22 mg·g-1;贾治勇等[15]通过单因素和正交试验，得到西兰花茎中提取硫苷的最佳工艺条件为：乙醇浓度75%、料液比为1∶15、提取温度为70 ℃、提取时间为30 min，在此条件下提取物中硫苷的提取质量摩尔浓度为601.24 μmol·g-1;邓艳美等[16]通过单因素和正交试验，得到青花菜干粉中提取硫苷的最佳条件为乙醇浓度75%、料液比为1∶7、提取温度80 ℃、提取时间为20 min，提取液中硫代葡萄糖苷质量摩尔浓度达到33.71 μmol·g-1。不同研究者得到的结果不同，笔者通过对青花菜花球中总硫苷的提取工艺的研究，提高其利用率，尤其在抗癌抑癌方面，旨在为人类健康做一些贡献，也为后续硫代葡萄糖苷的相关研究提供了一定的理论支撑。 2.2 不同干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响
由图3可以得出，不同干燥处理对青花菜花球总硫苷含量的影响不同。其中冷冻干燥处理青花菜花球测得的总硫苷含量最低;70 ℃鼓风干燥处理青花菜花球测得的总硫苷含量最高;微波干燥处理梯度间差异相对于鼓风干燥处理梯度间差异较大，微波干燥处理下测得青花菜总硫苷含量（b，后同）最大值和最小值相差34.92 μmol·g-1，而鼓风干燥处理下测得青花菜总硫苷含量最大值和最小值相差30.48 μmol·g-1。
2.2.1 微波干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响 在微波干燥处理中，微波中高火处理条件下青花菜总硫苷含量显著高于其他火力处理;除微波中火处理外，微波低火处理条件下青花菜总硫苷含量显著低于其他火力處理;微波低火与微波中火、微波中低火与微波中火、微波中低火与微波高火间均没有显著性差异。
2.2.2 鼓风干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响 在鼓风干燥处理中，鼓风干燥70 ℃显著高于其他鼓风干燥处理;除鼓风干燥60 ℃外，鼓风干燥50 ℃和鼓风干燥100℃显著低于其他鼓风干燥处理;鼓风干燥50 ℃、60 ℃和100 ℃没有显著性差异;鼓风干燥60 ℃和鼓风干燥80 ℃没有显著性差异;鼓风干燥80 ℃和鼓风干燥90 ℃没有显著性差异。
2.3 不同提取条件对青花菜总硫苷含量的影响
由表3可知，不同提取方式对青花菜总硫苷含量的影响不同。在乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度有差异时，青花菜中提取到的总硫苷含量也有差异。在25个处理中，在A1B0C0D4、A3B2C3D4、A0B0C3D3 处理下所提取出来的青花菜花球总硫苷含量分别为414.98、391.03、323.92 μmol·g-1，均显著高于其他处理所提取出来的总硫苷含量。而在A0B3C2D0、A1B3C3D1、A2B3C3D0、A3B3C0D1处理下所提取出来的青花菜总硫苷的量均显著低于其他处理，且提取出的总硫苷含量都低于在100 μmol·g-1，且这4组的温度都为90 ℃，表明提取温度90 ℃太高会影响硫苷含量的提取。乙醇浓度90%、料液比为1∶9、提取温度60 ℃、提取时间为30 min提取得到的总硫苷含量最高。
3 讨论与结论
在最近几年中，硫苷的提取鉴定引起了研究人员的极大兴趣。在《青花菜抗癌原理被发现》[19]一文中，青花菜的抗癌功效被证实，越来越多的人开始关注青花菜。沈莲清等[20]通过对西兰花种子中的硫苷进行了提取，验证了萝卜硫素对5种肿瘤细胞株均有显著的体外增殖抑制活性。黑芥子酶是降解硫苷的主要酶源，因此成为了抗癌研究的新方向[19]，丁艳等[22]通过对油菜籽饼粕中硫苷的酶解条件优化的研究，表明了黑芥子酶在不同条件下对硫苷的降解产物生成量存在差异。因此，想要在植物中提取高含量的硫苷，首先应该进行灭酶处理，以防硫苷酶解生成其他有害物质。
本试验研究结果表明，不同灭酶处理提取出的总硫苷含量存在差异，以100 ℃蒸馏水热处理提取效果最好。其中，试剂不同，相同处理方式提取的总硫苷含量不同，100 ℃蒸馏水提取的硫苷含量比75 ℃95%乙醇提取的总硫苷含量要高;相同的试剂，不同的灭酶处理方式提取的总硫苷含量也不同，100 ℃蒸馏水热处理提取硫苷含量显著高于微波处理提取总硫苷含量，75 ℃95%乙醇微波处理提取的总硫苷含量要高于热处理。
韩梦凡[23]研究表明结球甘蓝在干燥过程中显著抑制硫苷成分的降解，减少了有害产物的生成量，表明干燥处理对硫苷含量的提取有影响。本试验结果表明，鼓风干燥条件下，温度为50 ℃、60 ℃时干燥较慢，时间略长，使硫苷在干燥过程中发生降解，虽然80 ℃、90 ℃、100 ℃时青花菜花球水分散失较快，但高温还会使硫苷发生降解，所以70 ℃时干燥处理效果最好。相对于鼓风干燥而言，微波干燥迅速，时间短，并且受热均匀，火力中高火时效果最好，但为了防止过度受热使硫苷发生降解，需要在干燥过程中多次测量散失水分的质量，可能导致所需火力不能一直保持，增加了干燥时间，使得硫苷发生了降解。
李宁[6]在西兰花干硫苷的提取中，发现提取硫苷最佳的工艺条件为乙醇浓度为70%、料液比1∶10、提取温度80 ℃、提取时间为40 min;贾治勇等[15]在西兰花茎中硫苷的提取工艺研究中发现提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度75%、料液比1∶9、提取温度70 ℃、提取时间30 min;邓艳美[16]在青花菜硫代葡萄糖苷的提取工艺中发现提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度75%、料液比1∶7、提取温度80 ℃、提取时间30 min。本试验结果表明，提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度90%、料液比1∶9、提取温度60 ℃、提取时间30 min，其中最佳提取时间和料液比与前人的研究基本保持一致，但乙醇浓度和提取温度有所偏差。本试验最佳提取温度为60 ℃，这与李宁[6]研究得出的随着温度的提高硫苷提取含量增加的结论有差异，可能与试验材料品种等因素有关。本试验提取最佳乙醇浓度为90%，这与贾治勇等[15]研究得出的随着乙醇浓度增大硫苷提取量增大，但在75%达到最大值的结论有差异，可能是与测定的部位等因素有关。
综上所述，加入100 ℃蒸馏水后80 ℃热处理15 min灭酶处理，70 ℃鼓风干燥，乙醇浓度90%、料液比1∶9、提取温度60 ℃、提取时间30 min的提取条件下测得青花菜花球中总硫代葡萄糖苷含量最高，为414.98 μmol·g-1，其为花青菜花球中总硫苷提取的最佳工艺。
参考文献
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