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摘要：利用专一性底物法，以虎杖水提液为初始培养基，经过初筛复筛获得转化菌。根据菌落形态特征对菌株进行初步鉴定，对转化菌产酶的酶学性质进行研究。结果表明，通过筛选得到1株特异性转化虎杖苷为白藜芦醇的菌株，经形态学鉴定为青霉菌。该菌产的酶最适pH值为5.0，最适温度为60 ℃;Fe2 、Na 和Ca2 对酶活力有激活作用;虎杖苷是该酶理想的水解作用底物。利用该菌产的酶液转化虎杖原料，虎杖苷的转化率最高可达到100%。
关键词：白藜芦醇;青霉菌;微生物转化;虎杖苷
中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0264-04
虎杖是一种常用的中药原料，主要活性成分是虎杖苷（白藜芦醇苷）、白藜芦醇和蒽醌类化合物。其中，白藜芦醇活性较高，具有抗炎杀菌、抗氧化、抗肿瘤、保肝护肝、保护心血管及免疫調节等活性[1-8]。白藜芦醇的制备方法有传统提取法、微生物转化法、微生物发酵法。传统提取法主要以蓼科、葡萄科、豆科植物为原料提取[9-10]。其中，蓼科植物虎杖中白藜芦醇的含量可达0.45%，虎杖苷的含量最高可达2.55%[11]。虎杖苷是白藜芦醇与β-D-葡萄糖结合形成的糖苷，水解该糖苷键可以将虎杖苷转化成白藜芦醇[12]。如果能将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，理论上可使其含量提高3.3倍[13]，可以大大增加虎杖的药用价值。
针对虎杖苷中β-D-葡萄糖苷键的水解方法有化学法和生物法。化学降解法工序复杂，成本高，分离纯化困难，且白藜芦醇光热稳定性差[14]，所以对虎杖苷的化学降解方法研究得较少。生物转化法中，王辉以筛选出高活性β-葡萄糖苷酶为依据筛选出米曲霉，利用该菌摇瓶发酵46 h后，虎杖苷可以被完全转化为白藜芦醇[15]。田天丽筛选得到根霉 T-34，通过带渣固体发酵技术在最佳发酵条件下发酵24 h后虎杖苷的转化率可达98%[13]。冯薇等筛选出细菌转化虎杖苷，8 h转化率可达90%以上。微生物转化虎杖的本质是通过所产生的β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷，利用商品酶或利用微生物制备的酶制剂可用于虎杖苷的转化。王辉利用米曲霉所产的β-葡萄糖苷酶粗酶液直接处理虎杖粗药材，12 h转化率达100%[15]。
陈蓉蓉等对多种商品酶进行了筛选，确定以β-葡萄糖苷酶的转化效果最好，转化率高达98%[16]。生物酶的转化工艺较稳定，做成固定化酶可重复利用，转化效率高，但酶的纯化较为困难，商品酶成本高，在工业中的应用受到限制。利用微生物产酶转化虎杖苷较为可行，而筛选出转化时间短、转化效率高的菌种尤为重要。本试验筛选得到1株转化菌，对转化菌所产的β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究，并且用粗酶液直接转化虎杖原料粉末。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株：青霉菌。
初筛培养基（%）：10%虎杖煮提液，MgSO4 0.05 g，NaNO3 0.5 g，FeSO4 0.001 g，KH2PO4 0.1 g，琼脂1.8 g，pH值自然。
复筛培养基：10%虎杖煮提液，pH值自然。
固体产酶培养基：麸皮、豆粕粉（碳氮比为6 ∶ 4）。
固体营养液：磷酸氢二钠1 g，硫酸铵2 g，硫酸镁0.1 g，加水定容至100 mL，固液比为1 ∶ 2。
材料：虎杖药材产自江苏省宝华山。白藜芦醇苷、白藜芦醇对照品的纯度为98%，购自西安华翠生物技术有限公司。甲醇（HPLC级）、乙醇、乙睛（HPLC级）、乙酸乙酯。
仪器：GNP-9080隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备公司）;ES-315高压蒸汽灭菌锅（TOMY，Japan）;Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent公司）;HD-930型组合式全温摇床（江苏太仓市博莱特实验仪器厂）;高速离心机Sigma 3k30（Sigma公司）。
1.2 菌种筛选与鉴定
1.2.1 虎杖苷转化菌的筛选 初筛：取虎杖粉末用无菌水冲洗，梯度稀释，按常规方法涂布，30 ℃培养2 d，挑选出长势良好的单菌落，保藏待用。复筛：将初筛菌种活化培养，制成孢子悬液，转接至复筛培养基，30 ℃、160 rpm培养，取样检测。
1.2.2 菌种鉴定 将筛选到的菌株接种到PDA培养基上，在不同时间观察菌落生长性状，待产孢后取菌丝制作临时玻片在透视显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子，并描述它们的形态特征;用透视显微镜观察菌丝的自然生长和分支状况。根据形态特征对菌株进行分类鉴定。
1.3 酶学性质研究
1.3.1 粗酶液的制备 将活化后的菌种斜面用无菌水制成孢子悬浮液，接种到发酵产酶培养基，28 ℃条件下静止培养48 h。取固体曲，用pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浸提，固液比为1 ∶ 10，将其用尼龙纱布过滤，4 500 rpm离心15 min，上清液即为酶液。
1.3.2 β-葡萄糖苷酶最适温度及稳定性 在不同温度下分别以1%水杨苷和0.05%虎杖苷为底物，按常规法测定酶活力，分别于50、55、60、65、70 ℃测定酶活力。酶液分别在30、40、50、60、70 ℃下保温12 h，测定酶活力。取酶液，放于 60 ℃ 水浴中，分别在2、4、6、8、10、12 h取样，检测酶活力。
1.3.3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸碱稳定性的影响 分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液，常规方法测定酶活力。此外，将酶液与上述不同pH值缓冲液在60 ℃下放置1 h后，按常规法测定对应的酶活力。
1.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性 分别配制浓度为 0.5% 的甜菊苷、虎杖苷、水杨苷、纤维二糖、京尼平苷溶液，再以它们为底物，按常规法测定对应的酶活力。 1.3.5 不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活力的影响 选取氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钴为试剂，在酶反应液中分别加入上述金属离子，使其终浓度为1.0 mmol/L，于60 ℃温30 min，按常规法测定酶活力，以不加金属离子的酶活力为100%。
1.4 β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法
水杨苷法测定β-葡萄糖苷酶活力：于0.2 mL水杨苷溶液中加入0.2 mL酶液，混匀后60 ℃反应10 min，加入1 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂后沸水浴5 min，冷却后蒸馏水定容至10 mL，在540 nm下测定其吸光度。
酶活力单位定义：1 mL酶液在pH值5.0、60 ℃下催化反应1 min，产生1 μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 虎杖苷转化菌的篩选
通过初筛得到11株长势较好的菌种，菌株编号及转化27 h虎杖苷转化率如图1所示。初筛获得的11株菌种中，仅有H4、H6和2-6号菌有转化效果，且在转化27 h后转化率都达到了最大。其中H6号菌的转化率最高，为98%，故选取H6号菌作为虎杖苷转化菌株。
2.2 转化菌的鉴定
通过观察，菌落为绿色，背面为黄色。显微镜下观察并记录菌种的显微形态。由图2可知，显微镜下菌丝无色透明，表面光滑，有隔膜，直径为4～5 μm，菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗，分生孢子梗分枝呈扫帚状。孢子梗上着生分生孢子链，分生孢子为椭圆形，两端稍细，长5～7 μm，宽 3～4 μm。根据以上菌落形态、菌丝形状、孢子的形状及大小，初步确定为青霉属。
2.3 酶学性质研究
2.3.1 β-葡萄糖苷酶最适温度 由图3-a和图3-b可知，随着反应温度的增加，酶活力先提高后降低，在60 ℃时酶活力最高。以水杨苷为底物和以虎杖苷为底物测得的酶活力变化趋势一致。以水杨苷为底物测定酶活力能准确地反映该酶对底物的转化能力。
2.3.2 酶的稳定性影响 酶液分别在30、40、50、60、70 ℃下保温12 h，按常规法测定对应的酶活力。取酶液，放于60 ℃水浴中保藏，分别在2、4、6、8、10、12 h取样，常规方法检测酶活力。由图4可知，β-葡萄糖苷酶在50 ℃以下保温12 h后基本不失活，在60 ℃保温12 h后酶活力有损失，60 ℃以后酶活力损失较大。由图5可知，60 ℃下，1～10 h内酶活力较稳定，10 h后酶活力降幅较大。
2.3.3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸碱稳定性的影响 分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液，采用常规方法测定酶活力。此外，将酶液与上述不同pH值缓冲液在60 ℃下放置1 h后，按常规法测定其对应的酶活力。由图6可知，β-葡萄糖苷酶活力随着pH值的上升先提高后降低，在pH值为5.0时酶活力最高，这与多数文献报道的一致。由图7可知，酶在pH值为4.0～6.0之间时，相对酶活力较高，保持了较高的稳定性，在pH值
关键词：白藜芦醇;青霉菌;微生物转化;虎杖苷
中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0264-04
虎杖是一种常用的中药原料，主要活性成分是虎杖苷（白藜芦醇苷）、白藜芦醇和蒽醌类化合物。其中，白藜芦醇活性较高，具有抗炎杀菌、抗氧化、抗肿瘤、保肝护肝、保护心血管及免疫調节等活性[1-8]。白藜芦醇的制备方法有传统提取法、微生物转化法、微生物发酵法。传统提取法主要以蓼科、葡萄科、豆科植物为原料提取[9-10]。其中，蓼科植物虎杖中白藜芦醇的含量可达0.45%，虎杖苷的含量最高可达2.55%[11]。虎杖苷是白藜芦醇与β-D-葡萄糖结合形成的糖苷，水解该糖苷键可以将虎杖苷转化成白藜芦醇[12]。如果能将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，理论上可使其含量提高3.3倍[13]，可以大大增加虎杖的药用价值。
针对虎杖苷中β-D-葡萄糖苷键的水解方法有化学法和生物法。化学降解法工序复杂，成本高，分离纯化困难，且白藜芦醇光热稳定性差[14]，所以对虎杖苷的化学降解方法研究得较少。生物转化法中，王辉以筛选出高活性β-葡萄糖苷酶为依据筛选出米曲霉，利用该菌摇瓶发酵46 h后，虎杖苷可以被完全转化为白藜芦醇[15]。田天丽筛选得到根霉 T-34，通过带渣固体发酵技术在最佳发酵条件下发酵24 h后虎杖苷的转化率可达98%[13]。冯薇等筛选出细菌转化虎杖苷，8 h转化率可达90%以上。微生物转化虎杖的本质是通过所产生的β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷，利用商品酶或利用微生物制备的酶制剂可用于虎杖苷的转化。王辉利用米曲霉所产的β-葡萄糖苷酶粗酶液直接处理虎杖粗药材，12 h转化率达100%[15]。
陈蓉蓉等对多种商品酶进行了筛选，确定以β-葡萄糖苷酶的转化效果最好，转化率高达98%[16]。生物酶的转化工艺较稳定，做成固定化酶可重复利用，转化效率高，但酶的纯化较为困难，商品酶成本高，在工业中的应用受到限制。利用微生物产酶转化虎杖苷较为可行，而筛选出转化时间短、转化效率高的菌种尤为重要。本试验筛选得到1株转化菌，对转化菌所产的β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究，并且用粗酶液直接转化虎杖原料粉末。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株：青霉菌。
初筛培养基（%）：10%虎杖煮提液，MgSO4 0.05 g，NaNO3 0.5 g，FeSO4 0.001 g，KH2PO4 0.1 g，琼脂1.8 g，pH值自然。
复筛培养基：10%虎杖煮提液，pH值自然。
固体产酶培养基：麸皮、豆粕粉（碳氮比为6 ∶ 4）。
固体营养液：磷酸氢二钠1 g，硫酸铵2 g，硫酸镁0.1 g，加水定容至100 mL，固液比为1 ∶ 2。
材料：虎杖药材产自江苏省宝华山。白藜芦醇苷、白藜芦醇对照品的纯度为98%，购自西安华翠生物技术有限公司。甲醇（HPLC级）、乙醇、乙睛（HPLC级）、乙酸乙酯。
仪器：GNP-9080隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备公司）;ES-315高压蒸汽灭菌锅（TOMY，Japan）;Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent公司）;HD-930型组合式全温摇床（江苏太仓市博莱特实验仪器厂）;高速离心机Sigma 3k30（Sigma公司）。
1.2 菌种筛选与鉴定
1.2.1 虎杖苷转化菌的筛选 初筛：取虎杖粉末用无菌水冲洗，梯度稀释，按常规方法涂布，30 ℃培养2 d，挑选出长势良好的单菌落，保藏待用。复筛：将初筛菌种活化培养，制成孢子悬液，转接至复筛培养基，30 ℃、160 rpm培养，取样检测。
1.2.2 菌种鉴定 将筛选到的菌株接种到PDA培养基上，在不同时间观察菌落生长性状，待产孢后取菌丝制作临时玻片在透视显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子，并描述它们的形态特征;用透视显微镜观察菌丝的自然生长和分支状况。根据形态特征对菌株进行分类鉴定。
1.3 酶学性质研究
1.3.1 粗酶液的制备 将活化后的菌种斜面用无菌水制成孢子悬浮液，接种到发酵产酶培养基，28 ℃条件下静止培养48 h。取固体曲，用pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浸提，固液比为1 ∶ 10，将其用尼龙纱布过滤，4 500 rpm离心15 min，上清液即为酶液。
1.3.2 β-葡萄糖苷酶最适温度及稳定性 在不同温度下分别以1%水杨苷和0.05%虎杖苷为底物，按常规法测定酶活力，分别于50、55、60、65、70 ℃测定酶活力。酶液分别在30、40、50、60、70 ℃下保温12 h，测定酶活力。取酶液，放于 60 ℃ 水浴中，分别在2、4、6、8、10、12 h取样，检测酶活力。
1.3.3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸碱稳定性的影响 分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液，常规方法测定酶活力。此外，将酶液与上述不同pH值缓冲液在60 ℃下放置1 h后，按常规法测定对应的酶活力。
1.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性 分别配制浓度为 0.5% 的甜菊苷、虎杖苷、水杨苷、纤维二糖、京尼平苷溶液，再以它们为底物，按常规法测定对应的酶活力。 1.3.5 不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活力的影响 选取氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钴为试剂，在酶反应液中分别加入上述金属离子，使其终浓度为1.0 mmol/L，于60 ℃温30 min，按常规法测定酶活力，以不加金属离子的酶活力为100%。
1.4 β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法
水杨苷法测定β-葡萄糖苷酶活力：于0.2 mL水杨苷溶液中加入0.2 mL酶液，混匀后60 ℃反应10 min，加入1 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂后沸水浴5 min，冷却后蒸馏水定容至10 mL，在540 nm下测定其吸光度。
酶活力单位定义：1 mL酶液在pH值5.0、60 ℃下催化反应1 min，产生1 μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 虎杖苷转化菌的篩选
通过初筛得到11株长势较好的菌种，菌株编号及转化27 h虎杖苷转化率如图1所示。初筛获得的11株菌种中，仅有H4、H6和2-6号菌有转化效果，且在转化27 h后转化率都达到了最大。其中H6号菌的转化率最高，为98%，故选取H6号菌作为虎杖苷转化菌株。
2.2 转化菌的鉴定
通过观察，菌落为绿色，背面为黄色。显微镜下观察并记录菌种的显微形态。由图2可知，显微镜下菌丝无色透明，表面光滑，有隔膜，直径为4～5 μm，菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗，分生孢子梗分枝呈扫帚状。孢子梗上着生分生孢子链，分生孢子为椭圆形，两端稍细，长5～7 μm，宽 3～4 μm。根据以上菌落形态、菌丝形状、孢子的形状及大小，初步确定为青霉属。
2.3 酶学性质研究
2.3.1 β-葡萄糖苷酶最适温度 由图3-a和图3-b可知，随着反应温度的增加，酶活力先提高后降低，在60 ℃时酶活力最高。以水杨苷为底物和以虎杖苷为底物测得的酶活力变化趋势一致。以水杨苷为底物测定酶活力能准确地反映该酶对底物的转化能力。
2.3.2 酶的稳定性影响 酶液分别在30、40、50、60、70 ℃下保温12 h，按常规法测定对应的酶活力。取酶液，放于60 ℃水浴中保藏，分别在2、4、6、8、10、12 h取样，常规方法检测酶活力。由图4可知，β-葡萄糖苷酶在50 ℃以下保温12 h后基本不失活，在60 ℃保温12 h后酶活力有损失，60 ℃以后酶活力损失较大。由图5可知，60 ℃下，1～10 h内酶活力较稳定，10 h后酶活力降幅较大。
2.3.3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸碱稳定性的影响 分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液，采用常规方法测定酶活力。此外，将酶液与上述不同pH值缓冲液在60 ℃下放置1 h后，按常规法测定其对应的酶活力。由图6可知，β-葡萄糖苷酶活力随着pH值的上升先提高后降低，在pH值为5.0时酶活力最高，这与多数文献报道的一致。由图7可知，酶在pH值为4.0～6.0之间时，相对酶活力较高，保持了较高的稳定性，在pH值