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摘要：【目的】探究酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）及酚氧化酶在家蠶眠期血淋巴中的变化规律，为深入解析家蚕眠期酚氧化酶的功能及其基因表达特征提供新线索。【方法】以家蚕四龄将眠、四龄眠（头壳刚开裂）0 h、四龄眠6 h、四龄眠12 h、四龄眠24 h和五龄起蚕为试验材料，采用实时荧光定量PCR检测其血淋巴PPO1和PPO2基因的表达情况，并分析血淋巴酚氧化酶活性的变化规律。【结果】家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因在四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期均有一定程度的表达，且两者的变化规律一致，表现为四龄将眠最高、五龄起蚕最低，总体上呈先减后增再减的变化趋势。在家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性整体上也呈先降低后急剧升高再降低的变化趋势，四龄将眠为5.99 U/mg，五龄起蚕为6.02 U/mg，与酚氧化酶原基因表达模式基本一致。【结论】家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性变化规律与酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）的转录表达模式基本一致，说明酚氧化酶在家蚕眠期即发挥免疫防御功能，又参与蚕体新旧表皮的更替过程。
关键词： 家蚕;酚氧化酶;酚氧化酶原基因;眠期;血淋巴;变化规律
中图分类号： S881.21 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0391-06
Abstract：【Objective】In order to provide new clues for in-depth analysis on the function and gene expression characteristics of phenoloxidase in silkworm during molting， this study explored the change rules of the prophenoloxidase gene （PPO1 and PPO2） expression and phenoloxidase activities in hemolymph of silkworm during the molting stage. 【Method】The real-time fluorescent quantitative PCR was applied to analyze the expression of PPO1 and PPO2， meanwhile the activity of phenoloxidase in hemolymph were examined， using the silkworm at the point of the fourth instar molting 0 h（head capsule cracked）， 6 h， 12 h， 24 h and the newly molted fifth instar as the experimental materials. 【Result】PPO1 and PPO2 genes in silkworm hemolymph all expressed from upcoming forth instar molting to newly molted fifth instar， and the variation rules of the two genes were the same. The expression levels of PPO1 and PPO2 were the highest at the upcoming fourth instar molting and the lowest at the newly molted fifth instar. It showed a trend of descending first and then ascending. The phenoloxidase activities were basically consistent with the change of gene expression. They were 5.99 U/mg at the upcoming fourth instar molting and 6.02 U/mg at the newly molted fifth instar， which were reduced first and then increased sharply and then decreased during the different developmental stages. 【Conclusion】The change trend of phenoloxidase activity in hemolymph are basically consistent with transcription expression of prophenoloxidase genes（PPO1 and PPO2） in the different development stages from the fourth molting to the newly molted fifth instar，which suggests that the phenoloxidase may not only play the role of immune defense， but also participate in the epidermis replacement process during the molting stage of silkworm.
Key words： Bombyx mori; phenoloxidase; prophenoloxidase gene; molting stage; hemolymph; variation rule 0 引言
【研究意义】酚氧化酶（Phenoloxidase）又名酪氨酸酶，广泛分布于动植物体内（白霜等，2008;陈晓宇等，2015），在昆虫血淋巴中一般以无活性的酚氧化酶原（Prophenoloxidase，PPO）形式存在（Kan et al.，2008;Lu et al.，2014）。当机体受外源异物侵染时，酚氧化酶原通过丝氨酸蛋白酶及其抑制剂的共同作用，被转化为具有活性的酚氧化酶，活化酚氧化酶进一步催化酪氨酸形成醌类物质，调控细胞的吞噬及黑化等免疫防御过程（刘丽萍等，2013;王俊秀和李亚红，2015）。酚氧化酶的活性及含量常作为评价昆虫及无脊椎动物免疫能力的指标（李国荣等，2003;蒋经伟等，2015），因此探究家蚕眠期血淋巴酚氧化酶活性及其基因的表达变化规律，可为进一步揭示酚氧化酶在家蚕眠期的生理功能提供理论依据。【前人研究进展】昆虫缺乏哺乳类动物复杂的免疫球蛋白，主要通过体液免疫和细胞免疫抵御外源病原微生物侵染（张永红等，2017）。其中，昆虫体液免疫是通过Toll和IMD途径诱导产生抗菌肽，分泌到血淋巴中以抵御外源病原微生物的入侵;细胞免疫则是通过血细胞对外源病原微生物的吞噬和包被及黑化等作用所完成（Kingsolver et al.，2013）。关于黑化作用研究较多的是酚氧化酶原激活系统，包括多酚氧化酶原、多酚氧化酶、丝氨酸蛋白酶及其抑制剂、相关识别因子和外源异物等（Clark and Strand，2013;苑胜垒等，2016）。家蚕是鳞翅目模式昆虫的代表，也是一种具有极高经济价值的吐丝昆虫。早在1971年Ashida等就分离纯化了家蚕酚氧化酶并对其酶学基本性质进行研究，1999年Satoh等克隆获得家蚕酚氧化酶原基因（张永亮，2008;刘丽萍等，2013）。陈文柱等（2005）通过测定三龄眠后20 d的家蚕血淋巴酚氧化酶活力，发现家蚕酚氧化酶活力在各龄初期和末期较低，而在各龄中期相对较高，与家蚕各龄期的抗性规律一致，即酚氧化酶与家蚕抗性存在一定关联。张永亮和朱勇（2009）对家蚕的2个酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）进行转录表达分析，结果发现PPO1和PPO2基因表达具有明显的组织和时空特异性。Wang等（2013）研究表明，酚氧化酶与蜕皮激素协同调控家蚕蜕皮，且酚氧化酶原基因受蜕皮激素调控，干涉PPO1基因会导致家蚕不能正常化蛹。唐芬芬等（2016）研究证实，喂食家蚕核型多角体病毒（BmNPV）能诱导家蚕血淋巴酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）上调表达，且酚氧化酶活性显著增加，提示酚氧化酶在家蚕抗病毒免疫防御过程中发挥一定作用。毛钰霞等（2017）研究也发现，五龄家蚕幼虫酚氧化酶活性变化具有明显的发育时期和组织特异性，且不同品系间的酶活性存在差异。【本研究切入点】家蚕一般有4个眠期，进入眠期后主要表现为不吃不动，此时自身的能量代谢变慢，在一定程度上会影响相应的免疫防御能力。酚氧化酶作为一类重要的免疫蛋白，在昆虫免疫防御、表皮鞣化、黑化和伤口愈合等过程中发挥重要作用（刘丽萍等，2013;王俊秀和李亚红，2015），但至今有关家蚕眠期酚氧化酶活性及其基因表达规律的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以四龄将眠至五龄起蚕不同发育阶段的家蠶血淋巴为试验材料，检测分析酚氧化酶原基因的表达及其活性变化，旨在明确家蚕眠期血淋巴PPO1和PPO2基因及酚氧化酶的变化规律，为深入解析家蚕眠期酚氧化酶的功能及基因表达特征提供新线索。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
家蚕品系大造（Dazao）人工孵化，在25 ℃恒温培养箱中桑叶饲养。主要试剂：高纯总RNA快速提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，货号RP1202）、反转录试剂盒（TaKaRa公司，货号RR047A）、荧光定量试剂（Bio-Rad公司，货号1725121）。主要仪器设备：PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳仪、凝胶成像系统、低温高速离心机和CFX-96实时荧光定量PCR检测仪等。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品采集 分别收集家蚕四龄将眠（停食）、四龄眠（头壳刚开裂）0 h、四龄眠6 h、四龄眠12 h、四龄眠24 h和五龄起蚕的血淋巴，每6头蚕的血淋巴为一份样品（收集于同一预冷离心管中），每次取样均设5个重复;每份血淋巴又分为两份，一份用于抽总提RNA，一份用于制备酶液。取样过程均在冰上操作，样品收集后-80 ℃保存备用。
1. 2. 2 RNA提取及反转录 按照高纯总RNA快速提取试剂盒说明抽提家蚕血淋巴总RNA。在核酸蛋白分析仪上测定OD260/OD280，计算RNA样品浓度，并反转录合成cDNA。
1. 2. 3 引物设计 以真核翻译起始因子4A基因（家蚕芯片探针ID：SW22934）为荧光定量内参基因，酚氧化酶原基因PPO1（GenBank登录号BAA08368）和PPO2（GenBank登录号BAA08369）为靶标基因，家蚕管家基因Actin3（GenBank登录号X04507）用于检测cDNA模板质量。利用Primer Premier 5.0设计引物（表1）。
1. 2. 4 cDNA模板和靶标基因引物检测 利用表1中家蚕管家基因Actin3引物、酚氧化酶原基因PPO1和PPO2引物，以家蚕血淋巴cDNA为模板进行PCR扩增，扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1. 2. 5 实时荧光定量PCR检测 参照实时荧光定量PCR试剂盒说明进行操作，扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环;65 ℃ 5 s（每次增加0.5 ℃，直到95 ℃）。CFX-96实时荧光定量PCR检测仪记录试验数据，以2?△△Ct法计算目的基因相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），并利用Excel 2016进行数据处理及制图。 1. 2. 6 酶活性测定 取1.5 mL家蚕血淋巴，加入0.5 mL二甲胂酸钠（CAC）缓冲液，4 ℃下7500 r/min离心15 min，上清液即为待测酶液。参照唐芬芬等（2016）的方法测定酶活性：取50 ?L待测酶液，加入40 ?L的0.1 mol/L氯代十六烷基吡啶（CPC），30 ℃孵育10 min，再加入50 ?L的0.02 mol/L L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）继续孵育1 min，最后以CAC缓冲液补足至3.0 mL。在490 nm处测定1 min内吸光值的增加值，重复5次。以每毫克蛋白吸光值增加0.001为一个酶单位（U），计算酶活性。
2 结果与分析
2. 1 PCR检测结果
为保证实时荧光定量PCR检测结果的准确性，不仅需要高质量的cDNA模板，还要求设计的引物必须具有特异性，不能产生明显的引物二聚体。为此，本研究以反转录获得的cDNA为模板，用家蚕管家基因Actin3引物进行模板质量PCR检测。结果如图1所示，所有cDNA模板均能扩增出亮度均一的目的基因条带，说明反转录得到的cDNA模板质量较高，可用于后续的实时荧光定量PCR检测。同时对PPO1和PPO2基因定量引物进行PCR检测，结果发现在不同cDNA模板中均可扩增出单一的PPO1和PPO2基因条带，且无明显的引物二聚体条带产生（图2），表明设计的定量引物特异性较好，能满足实时荧光定量PCR检测要求。
2. 2 家蚕PPO1和PPO2基因的表达情况
利用实时荧光定量PCR对家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴PPO1和PPO2基因进行检测分析，结果如图3所示。在家蚕四龄将眠至五龄起蚕的不同发育时期，其血淋巴PPO1和PPO2基因的相对表达量均以四龄将眠最高、五龄起蚕最低。在整个四龄眠期，家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因的相对表达量均呈先减少后增加的变化趋势，且PPO2基因的相对表达量整体上略高于PPO1基因。在整个试验观察期内，家蚕血淋巴中两个酚氧化酶原基因的转录表达规律相似。
2. 3 不同发育时期家蚕血淋巴酚氧化酶活性变化规律
如图4所示，家蚕血淋巴酚氧化酶活性在四龄将眠为5.99 U/mg，五龄起蚕为6.02 U/mg。在整个四龄眠期，家蚕血淋巴酚氧化酶活性呈先降低后急剧升高的变化趋势，以四龄眠12 h最低（3.37 U/mg），随后急剧升高，至四龄眠24 h酶活性达最高值（8.47 U/mg）。综合家蚕PPO1和PPO2基因的表达情况发现，酚氧化酶活性变化趋势与酚氧化酶原基因表达模式基本一致。
3 讨论
休眠蜕皮是家蚕的重要生理特征之一，幼虫的蜕皮包括真皮细胞活性增强、表皮分离、蜕皮液分泌、新表皮形成和旧表皮蜕去等一系列连续过程（冯丽春和沈卫德，2015）。新形成的外表皮是在家蚕眠后期由内表皮转化而来，在这一转化过程中需经孔道运送酚氧化酶至上表皮，使酪氨酸氧化生成二羟苯丙氨酸及相应的醌类物质，醌类物质与外层内表皮中的节肢蛋白结合，鞣化生成坚硬而不溶的骨蛋白，使内表皮的外层硬化成外表皮。在形成新表皮的同時伴随着黑色素形成，而在黑色素的形成过程中Yellow蛋白和酚氧化酶发挥着极其重要的作用（Wittkopp et al.，2002，2003）。在昆虫蜕皮过程中，蜕皮激素和保幼激素共同决定了新表皮层的生成和发育。蜕皮激素20E还能显著上调南瓜实蝇和家蚕PPO1基因的表达，干涉幼虫化蛹（Wang et al.，2013;Zhang et al.，2018），暗示蜕皮激素与酚氧化酶协同调控昆虫的蜕皮变态。
昆虫进入眠期发育时处于停食的相对饥饿状态和对病原抵抗力的相对薄弱环节，但此时昆虫会发生某种免疫机制，提高细胞或体液中的相关效应因子，主动激活自身机体的防御能力（Tsuzuki et al.，2012;Guo et al.，2014;邵榆岚等，2017）。酚氧化酶不仅参与昆虫的体液免疫或细胞免疫防御过程，还在新表皮的鞣化、硬化和表皮着色过程中发挥重要作用（Theopold et al.，2004）。本研究的实时荧光定量PCR检测结果显示，家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因在四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期均有一定程度的表达，且两者的变化规律一致，表现为四龄将眠最高、五龄起蚕最低，总体上呈先减后增再减的变化趋势。家蚕血淋巴酚氧化酶活性测定结果显示，在家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性整体上也呈先降低后急剧升高再降低的变化趋势，四龄将眠为5.99 U/mg、五龄起蚕为6.02 U/mg，与酚氧化酶原基因表达模式基本一致。
酚氧化酶原基因的表达模式及酶活变化规律与蚕体发育进程密切相关。家蚕从四龄将眠至四龄眠6 h，机体的代谢变慢，酚氧化酶及其他免疫蛋白也随之减少，因此酚氧化酶原基因表达下降，其酶活性减弱。在家蚕四龄眠12和24 h，机体免疫防御相对薄弱，但酚氧化酶原基因表达逐渐增加，对应的酶活性从眠24 h开始急剧上升至最高值，推测此时基因表达量和酶活性的增强是家蚕机体通过其他方式主动提高自身免疫能力。Asano和Ashida（2001）研究发现，家蚕表皮中酚氧化酶不能转运至血淋巴，但血淋巴中的酚氧化酶经修饰后可转运至表皮。家蚕眠期一个重要的生理进程就是蜕去旧表皮合成新表皮（冯丽春和沈卫德，2015）。四龄眠12和24 h是蚕体合成新表皮的关键时期之一，表皮的鞣化、硬化及色素的沉积都需要酚氧化酶参与，此时血淋巴酚氧化酶原基因表达量增加及酶活性增强很有可能是为了转运酚氧化酶至表皮而参与新表皮的形成。这也提示血淋巴酚氧化酶及PPO1和PPO2基因在家蚕新表皮形成中发挥着重要作用。
4 结论
家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性变化规律与酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的转录表达模式基本一致，说明酚氧化酶在家蚕眠期即发挥免疫防御功能，又参与蚕体新旧表皮的更替过程。 参考文献：
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（責任编辑 兰宗宝）
关键词： 家蚕;酚氧化酶;酚氧化酶原基因;眠期;血淋巴;变化规律
中图分类号： S881.21 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0391-06
Abstract：【Objective】In order to provide new clues for in-depth analysis on the function and gene expression characteristics of phenoloxidase in silkworm during molting， this study explored the change rules of the prophenoloxidase gene （PPO1 and PPO2） expression and phenoloxidase activities in hemolymph of silkworm during the molting stage. 【Method】The real-time fluorescent quantitative PCR was applied to analyze the expression of PPO1 and PPO2， meanwhile the activity of phenoloxidase in hemolymph were examined， using the silkworm at the point of the fourth instar molting 0 h（head capsule cracked）， 6 h， 12 h， 24 h and the newly molted fifth instar as the experimental materials. 【Result】PPO1 and PPO2 genes in silkworm hemolymph all expressed from upcoming forth instar molting to newly molted fifth instar， and the variation rules of the two genes were the same. The expression levels of PPO1 and PPO2 were the highest at the upcoming fourth instar molting and the lowest at the newly molted fifth instar. It showed a trend of descending first and then ascending. The phenoloxidase activities were basically consistent with the change of gene expression. They were 5.99 U/mg at the upcoming fourth instar molting and 6.02 U/mg at the newly molted fifth instar， which were reduced first and then increased sharply and then decreased during the different developmental stages. 【Conclusion】The change trend of phenoloxidase activity in hemolymph are basically consistent with transcription expression of prophenoloxidase genes（PPO1 and PPO2） in the different development stages from the fourth molting to the newly molted fifth instar，which suggests that the phenoloxidase may not only play the role of immune defense， but also participate in the epidermis replacement process during the molting stage of silkworm.
Key words： Bombyx mori; phenoloxidase; prophenoloxidase gene; molting stage; hemolymph; variation rule 0 引言
【研究意义】酚氧化酶（Phenoloxidase）又名酪氨酸酶，广泛分布于动植物体内（白霜等，2008;陈晓宇等，2015），在昆虫血淋巴中一般以无活性的酚氧化酶原（Prophenoloxidase，PPO）形式存在（Kan et al.，2008;Lu et al.，2014）。当机体受外源异物侵染时，酚氧化酶原通过丝氨酸蛋白酶及其抑制剂的共同作用，被转化为具有活性的酚氧化酶，活化酚氧化酶进一步催化酪氨酸形成醌类物质，调控细胞的吞噬及黑化等免疫防御过程（刘丽萍等，2013;王俊秀和李亚红，2015）。酚氧化酶的活性及含量常作为评价昆虫及无脊椎动物免疫能力的指标（李国荣等，2003;蒋经伟等，2015），因此探究家蚕眠期血淋巴酚氧化酶活性及其基因的表达变化规律，可为进一步揭示酚氧化酶在家蚕眠期的生理功能提供理论依据。【前人研究进展】昆虫缺乏哺乳类动物复杂的免疫球蛋白，主要通过体液免疫和细胞免疫抵御外源病原微生物侵染（张永红等，2017）。其中，昆虫体液免疫是通过Toll和IMD途径诱导产生抗菌肽，分泌到血淋巴中以抵御外源病原微生物的入侵;细胞免疫则是通过血细胞对外源病原微生物的吞噬和包被及黑化等作用所完成（Kingsolver et al.，2013）。关于黑化作用研究较多的是酚氧化酶原激活系统，包括多酚氧化酶原、多酚氧化酶、丝氨酸蛋白酶及其抑制剂、相关识别因子和外源异物等（Clark and Strand，2013;苑胜垒等，2016）。家蚕是鳞翅目模式昆虫的代表，也是一种具有极高经济价值的吐丝昆虫。早在1971年Ashida等就分离纯化了家蚕酚氧化酶并对其酶学基本性质进行研究，1999年Satoh等克隆获得家蚕酚氧化酶原基因（张永亮，2008;刘丽萍等，2013）。陈文柱等（2005）通过测定三龄眠后20 d的家蚕血淋巴酚氧化酶活力，发现家蚕酚氧化酶活力在各龄初期和末期较低，而在各龄中期相对较高，与家蚕各龄期的抗性规律一致，即酚氧化酶与家蚕抗性存在一定关联。张永亮和朱勇（2009）对家蚕的2个酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）进行转录表达分析，结果发现PPO1和PPO2基因表达具有明显的组织和时空特异性。Wang等（2013）研究表明，酚氧化酶与蜕皮激素协同调控家蚕蜕皮，且酚氧化酶原基因受蜕皮激素调控，干涉PPO1基因会导致家蚕不能正常化蛹。唐芬芬等（2016）研究证实，喂食家蚕核型多角体病毒（BmNPV）能诱导家蚕血淋巴酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）上调表达，且酚氧化酶活性显著增加，提示酚氧化酶在家蚕抗病毒免疫防御过程中发挥一定作用。毛钰霞等（2017）研究也发现，五龄家蚕幼虫酚氧化酶活性变化具有明显的发育时期和组织特异性，且不同品系间的酶活性存在差异。【本研究切入点】家蚕一般有4个眠期，进入眠期后主要表现为不吃不动，此时自身的能量代谢变慢，在一定程度上会影响相应的免疫防御能力。酚氧化酶作为一类重要的免疫蛋白，在昆虫免疫防御、表皮鞣化、黑化和伤口愈合等过程中发挥重要作用（刘丽萍等，2013;王俊秀和李亚红，2015），但至今有关家蚕眠期酚氧化酶活性及其基因表达规律的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以四龄将眠至五龄起蚕不同发育阶段的家蠶血淋巴为试验材料，检测分析酚氧化酶原基因的表达及其活性变化，旨在明确家蚕眠期血淋巴PPO1和PPO2基因及酚氧化酶的变化规律，为深入解析家蚕眠期酚氧化酶的功能及基因表达特征提供新线索。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
家蚕品系大造（Dazao）人工孵化，在25 ℃恒温培养箱中桑叶饲养。主要试剂：高纯总RNA快速提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，货号RP1202）、反转录试剂盒（TaKaRa公司，货号RR047A）、荧光定量试剂（Bio-Rad公司，货号1725121）。主要仪器设备：PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳仪、凝胶成像系统、低温高速离心机和CFX-96实时荧光定量PCR检测仪等。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品采集 分别收集家蚕四龄将眠（停食）、四龄眠（头壳刚开裂）0 h、四龄眠6 h、四龄眠12 h、四龄眠24 h和五龄起蚕的血淋巴，每6头蚕的血淋巴为一份样品（收集于同一预冷离心管中），每次取样均设5个重复;每份血淋巴又分为两份，一份用于抽总提RNA，一份用于制备酶液。取样过程均在冰上操作，样品收集后-80 ℃保存备用。
1. 2. 2 RNA提取及反转录 按照高纯总RNA快速提取试剂盒说明抽提家蚕血淋巴总RNA。在核酸蛋白分析仪上测定OD260/OD280，计算RNA样品浓度，并反转录合成cDNA。
1. 2. 3 引物设计 以真核翻译起始因子4A基因（家蚕芯片探针ID：SW22934）为荧光定量内参基因，酚氧化酶原基因PPO1（GenBank登录号BAA08368）和PPO2（GenBank登录号BAA08369）为靶标基因，家蚕管家基因Actin3（GenBank登录号X04507）用于检测cDNA模板质量。利用Primer Premier 5.0设计引物（表1）。
1. 2. 4 cDNA模板和靶标基因引物检测 利用表1中家蚕管家基因Actin3引物、酚氧化酶原基因PPO1和PPO2引物，以家蚕血淋巴cDNA为模板进行PCR扩增，扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1. 2. 5 实时荧光定量PCR检测 参照实时荧光定量PCR试剂盒说明进行操作，扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环;65 ℃ 5 s（每次增加0.5 ℃，直到95 ℃）。CFX-96实时荧光定量PCR检测仪记录试验数据，以2?△△Ct法计算目的基因相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），并利用Excel 2016进行数据处理及制图。 1. 2. 6 酶活性测定 取1.5 mL家蚕血淋巴，加入0.5 mL二甲胂酸钠（CAC）缓冲液，4 ℃下7500 r/min离心15 min，上清液即为待测酶液。参照唐芬芬等（2016）的方法测定酶活性：取50 ?L待测酶液，加入40 ?L的0.1 mol/L氯代十六烷基吡啶（CPC），30 ℃孵育10 min，再加入50 ?L的0.02 mol/L L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）继续孵育1 min，最后以CAC缓冲液补足至3.0 mL。在490 nm处测定1 min内吸光值的增加值，重复5次。以每毫克蛋白吸光值增加0.001为一个酶单位（U），计算酶活性。
2 结果与分析
2. 1 PCR检测结果
为保证实时荧光定量PCR检测结果的准确性，不仅需要高质量的cDNA模板，还要求设计的引物必须具有特异性，不能产生明显的引物二聚体。为此，本研究以反转录获得的cDNA为模板，用家蚕管家基因Actin3引物进行模板质量PCR检测。结果如图1所示，所有cDNA模板均能扩增出亮度均一的目的基因条带，说明反转录得到的cDNA模板质量较高，可用于后续的实时荧光定量PCR检测。同时对PPO1和PPO2基因定量引物进行PCR检测，结果发现在不同cDNA模板中均可扩增出单一的PPO1和PPO2基因条带，且无明显的引物二聚体条带产生（图2），表明设计的定量引物特异性较好，能满足实时荧光定量PCR检测要求。
2. 2 家蚕PPO1和PPO2基因的表达情况
利用实时荧光定量PCR对家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴PPO1和PPO2基因进行检测分析，结果如图3所示。在家蚕四龄将眠至五龄起蚕的不同发育时期，其血淋巴PPO1和PPO2基因的相对表达量均以四龄将眠最高、五龄起蚕最低。在整个四龄眠期，家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因的相对表达量均呈先减少后增加的变化趋势，且PPO2基因的相对表达量整体上略高于PPO1基因。在整个试验观察期内，家蚕血淋巴中两个酚氧化酶原基因的转录表达规律相似。
2. 3 不同发育时期家蚕血淋巴酚氧化酶活性变化规律
如图4所示，家蚕血淋巴酚氧化酶活性在四龄将眠为5.99 U/mg，五龄起蚕为6.02 U/mg。在整个四龄眠期，家蚕血淋巴酚氧化酶活性呈先降低后急剧升高的变化趋势，以四龄眠12 h最低（3.37 U/mg），随后急剧升高，至四龄眠24 h酶活性达最高值（8.47 U/mg）。综合家蚕PPO1和PPO2基因的表达情况发现，酚氧化酶活性变化趋势与酚氧化酶原基因表达模式基本一致。
3 讨论
休眠蜕皮是家蚕的重要生理特征之一，幼虫的蜕皮包括真皮细胞活性增强、表皮分离、蜕皮液分泌、新表皮形成和旧表皮蜕去等一系列连续过程（冯丽春和沈卫德，2015）。新形成的外表皮是在家蚕眠后期由内表皮转化而来，在这一转化过程中需经孔道运送酚氧化酶至上表皮，使酪氨酸氧化生成二羟苯丙氨酸及相应的醌类物质，醌类物质与外层内表皮中的节肢蛋白结合，鞣化生成坚硬而不溶的骨蛋白，使内表皮的外层硬化成外表皮。在形成新表皮的同時伴随着黑色素形成，而在黑色素的形成过程中Yellow蛋白和酚氧化酶发挥着极其重要的作用（Wittkopp et al.，2002，2003）。在昆虫蜕皮过程中，蜕皮激素和保幼激素共同决定了新表皮层的生成和发育。蜕皮激素20E还能显著上调南瓜实蝇和家蚕PPO1基因的表达，干涉幼虫化蛹（Wang et al.，2013;Zhang et al.，2018），暗示蜕皮激素与酚氧化酶协同调控昆虫的蜕皮变态。
昆虫进入眠期发育时处于停食的相对饥饿状态和对病原抵抗力的相对薄弱环节，但此时昆虫会发生某种免疫机制，提高细胞或体液中的相关效应因子，主动激活自身机体的防御能力（Tsuzuki et al.，2012;Guo et al.，2014;邵榆岚等，2017）。酚氧化酶不仅参与昆虫的体液免疫或细胞免疫防御过程，还在新表皮的鞣化、硬化和表皮着色过程中发挥重要作用（Theopold et al.，2004）。本研究的实时荧光定量PCR检测结果显示，家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因在四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期均有一定程度的表达，且两者的变化规律一致，表现为四龄将眠最高、五龄起蚕最低，总体上呈先减后增再减的变化趋势。家蚕血淋巴酚氧化酶活性测定结果显示，在家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性整体上也呈先降低后急剧升高再降低的变化趋势，四龄将眠为5.99 U/mg、五龄起蚕为6.02 U/mg，与酚氧化酶原基因表达模式基本一致。
酚氧化酶原基因的表达模式及酶活变化规律与蚕体发育进程密切相关。家蚕从四龄将眠至四龄眠6 h，机体的代谢变慢，酚氧化酶及其他免疫蛋白也随之减少，因此酚氧化酶原基因表达下降，其酶活性减弱。在家蚕四龄眠12和24 h，机体免疫防御相对薄弱，但酚氧化酶原基因表达逐渐增加，对应的酶活性从眠24 h开始急剧上升至最高值，推测此时基因表达量和酶活性的增强是家蚕机体通过其他方式主动提高自身免疫能力。Asano和Ashida（2001）研究发现，家蚕表皮中酚氧化酶不能转运至血淋巴，但血淋巴中的酚氧化酶经修饰后可转运至表皮。家蚕眠期一个重要的生理进程就是蜕去旧表皮合成新表皮（冯丽春和沈卫德，2015）。四龄眠12和24 h是蚕体合成新表皮的关键时期之一，表皮的鞣化、硬化及色素的沉积都需要酚氧化酶参与，此时血淋巴酚氧化酶原基因表达量增加及酶活性增强很有可能是为了转运酚氧化酶至表皮而参与新表皮的形成。这也提示血淋巴酚氧化酶及PPO1和PPO2基因在家蚕新表皮形成中发挥着重要作用。
4 结论
家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性变化规律与酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的转录表达模式基本一致，说明酚氧化酶在家蚕眠期即发挥免疫防御功能，又参与蚕体新旧表皮的更替过程。 参考文献：
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（責任编辑 兰宗宝）