【摘 要】
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目的研究HIV-1 Nef蛋白氨基酸位点变异对其抑制神经细胞自噬的影响，探讨Nef蛋白致中枢神经系统损伤的机制。方法分别扩增和克隆1例HIV相关性痴呆(HIV－associated dementia，HAD)患者(H)及1例非AIDS HAD患者(N)中枢神经系统颞叶(temporal cortex，TC)部位的HIV-1 nef基因，进行序列分析，研究氨基酸位点变异；构建H-TC和N-TC来源的
【机 构】
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山东大学公共卫生学院卫生微生物检验学系 山东省"十三五"高校重点实验室，济南 250012,山东大学公共卫生学院卫生微生物检验学系 山东省"十三五"高校重点实验室，济南 250012,山东大学
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目的研究HIV-1 Nef蛋白氨基酸位点变异对其抑制神经细胞自噬的影响，探讨Nef蛋白致中枢神经系统损伤的机制。
方法分别扩增和克隆1例HIV相关性痴呆(HIV－associated dementia，HAD)患者(H)及1例非AIDS HAD患者(N)中枢神经系统颞叶(temporal cortex，TC)部位的HIV-1 nef基因，进行序列分析，研究氨基酸位点变异；构建H-TC和N-TC来源的Nef真核表达载体p EGFP-N1－nef，并分别转染U87细胞，观察绿色荧光蛋白并初步判断Nef蛋白表达情况；同时Western blot检测U87细胞Nef蛋白及细胞自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达，分析不同来源的Nef对U87细胞自噬的影响。
结果PCR扩增并构建H-TC及N-TC nef基因克隆载体pMD-19T-nef，测序证实为HIV-1B亚型，氨基酸序列分析显示，H-TC与N-TC关键氨基酸位点存在差异；成功构建pEGFP-N1－nef重组质粒，在U87细胞内表达Nef蛋白，转染后48 h Nef蛋白表达量最高；Western blot结果分析表明，LC3-Ⅱ蛋白的表达量在组间的差异有统计学意义(F＝11.764，P＝0.001)，两组细胞中LC3－Ⅱ含量较低，Western blot未能检测到。，空白组与空载体组之间LC3-Ⅱ的表达量差异无统计学意义(P＝0.169)，H-TC、N-TC及阳性对照CQ组LC3-Ⅱ表达升高，与空白对照或空载体相比，差异具有统计学意义(P＝0.017，P＝0.039，P＝0.031)，且H-TC组LC3-Ⅱ的表达量高于N-TC组(P＝0.023)；H-TC、N-TC及阳性对照CQ组p62蛋白的表达量较空白对照或空载体组有所升高，但组间差异无统计学意义(F＝2.049，P＝0.163)。
结论HAD及非HAD患者中枢神经系统中HIV-1 Nef氨基酸位点存在差异，对U87细胞自噬的影响也因此不同，H-TC来源的Nef诱导自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达的能力更强。
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