论文部分内容阅读
背景与目的:survivin是一种重要的抗凋亡基因,在肿瘤组织中特异性高表达,并参与调控细胞周期和细胞凋亡,其高表达与肿瘤进展、药物抵抗以及预后关系密切.但survivin在肺癌中高表达的转录调控机制研究甚少.课题组前期研究成功构建含有survivin核心启动子的荧光报告载体pGL3-SVP230-1uc,并发现核心启动子区存在缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 α,HIF-1 α)的潜在位点.本研究拟通过免疫荧光双标记法、电泳迁移率实验(EMSA)、共转染等方法探讨缺氧条件下人肺腺癌细胞株A549中HIF-1 α调控survivin转录的确切机制.方法:(1)运用免疫荧光双标记检测缺氧A549细胞中HIF-1 α与survivin的表达；(2)HIF-1α表达质粒和HIF-1α siRNA分别转染A549细胞,30 h后RT-PCR、Western blot和免疫荧光双标法检测survivin mRNA和蛋白表达；(3)pGL3-SVP230-luc(含有survivin核心启动子的荧光报告载体)与HIF-1 α表达质粒和HIF-1α siRNA分别共转染A549细胞,测定萤光素酶的表达活性；(4)EMSA分析HIF-1 α与survivin核心启动子结合情况；(5)流式细胞术和MTT法检测细胞凋亡和增殖.结果:(1)HIF-1 α与survivin共表达于A549细胞中；(2)转染HIF-1α表达质粒组survivin mRNA和蛋白表达水平显著上调,转染HIF-1 α siRNA组survivin mRNA和蛋白表达显著降低(P＜0.01)；(3)HIF-1 α表达质粒组pGL3-SVP230-luc相对活性分别为78.84,显著高于空质粒组及对照组(P＜0.01),HIF-1 α siRNA组pGL3-SVP230-luc相对活性分别为28.84,显著低于空质粒组及对照组(P均＜0.01);(4)HIF-1α与survivin核心启动子区转录起始点上游-19～-16 bp序列结合转录激活survivin(5)流式细胞术和MTT检测结果显示,HIF-1 α siRNA组细胞凋亡显著增加,细胞抑制率明显升高,与对照组相比差异具有统计学意义(P均＜0.01).结论:缺氧状态下A549细胞中survivin与HIF-1 α存在共表达；HIF-1 α可以通过survivin核心启动子区的结合位点激活survivin转录和表达;靶向HIF-1 α可以诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖,并为survivin的靶向治疗研究提供了进一步的实验基础.