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摘 要 利用经PCR、GUS染色和Southern杂交均证明已成功转入HbCBF1的、田间表型为矮化的橡胶树植株C1为材料，通过TAIL-PCR的方法获得T-DNA右侧侧翼序列1.6 kb，根据侧翼序列与载体的序列设计引物分析验证该序列真实可靠，并设计引物判断基因的T-DNA插入以杂合位点存在，与此同时，将该侧翼序列与已有的橡胶树基因组测序结果进行比对分析，发现该插入位点处并不存在基因，根据CBF1与CaMV35s启动子的研究推测，C1植株的矮化表型是由于CaMV35s启动子驱动抗逆基因导致，而非插入基因造成。
关键词 HbCBF1；T-DNA；纯合/杂合；矮化；橡胶树
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Abstract The C1 plant transferred HbCBF1 successfully was used as the material， verified by PCR， GUS staining and Southern blot， the phenotype of C1 in the field was dwarf. Using the method of TAIL-PCR， we got the 1.6 Kb flanking sequence of T-DNA， combing with the sequence of vector pCAMBIA2301， we designed three pairs of primers to validate that the sequence was reliable， and judge that the insertion site of T-DNA was heterozygous. Meanwhile， we compared and analyzed the flanking sequence with the genome sequencing result of rubber， and found that there was no gene in the T-DNA insertion site. According to the study of CBF1 and CaMV35s promoter， we speculated that the dwarf phenotype of C1 was induced by the CBF1 gene driven by CaMV35s promoter， instead of the gene of T-DNA insertion.
Key words HbCBF1； T-DNA； Homozygosis / heterozygosis； Dwarf mutant； Hevea brasiliensis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.014
CBF/DREB（C-repeat-binding-factor / dehydration-responsive-element-binding）转录因子作为低温、盐碱胁迫和干旱应答的重要成分，经胁迫诱导后，与下游基因启动子的CRT/DRE（C-repeat / dehydration-responsive-element）元件结合，调节大量含有该元件的抗逆基因表达，从而增强植株对多种逆境的抵抗性[1-2]。但该转录因子在影响植株抗逆性的同时也会影响植株的生长，主要分为以下4种类型，分别是抗逆性提高，伴随矮化[3-5]；抗逆性提高，非矮化[6-7]；抗逆性无明显提高，伴随矮化[8-9]和抗逆性无明显提高，非矮化[10]等。对于矮化的机理方面研究者主要集中在植物激素[11]、启动子[12-13]和外源基因调控相关基因的表达[14-15]等方面，但CBF/DREB转基因植株的矮化可能是由上述某个或某几个因素引起，也有可能有未知因素引起，目前仍没有系统的、确凿的证据阐释矮化机理[16]。
T-DNA插入位点侧翼序列的扩增方法主要有TAIL-PCR法（热不对称交错PCR）、I-PCR法（反向PCR）和Plasmid rescue法（质粒挽救）等，其中TAIL-PCR法是仅使用PCR来扩增侧翼序列的方法，具有简单及高效性，尤其适用于大规模样品未知序列的分离[17-18]。在植物基因组学研究中已建立一套较为完整的、稳定的用于T-DNA插入获得突变体侧翼序列的方法体系[19-20]。
本研究以获得的转HbCBF1阳性植株C1为材料，采用TAIL-PCR的方法成功克隆到该植株T-DNA插入位点的侧翼序列，根据该侧翼序列与橡胶树基因组进行比对，分析插入位点的相关信息，为揭示矮化表型奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
橡胶树转HbCBF1阳性植株C1（CaMV35s启动子启动HbCBF1，表达载体是pCAMBIA2301）和橡胶树无性系热研7-33-97，2011年11月定植于中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃内。
PCR反应所需要的Taq酶购于Fermantas公司，pMDR-19T vector（Takara）、2 kb DNA Ladder和15 kb DNA Ladder和TAIL-PCR用的酶Ex TaqR购于大连宝生物公司。dNTP购于北京全式金生物技术有限公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit购于OMEGA公司。DNA提取试剂盒购于TIANGEN公司（TIANGEN Cat. #DP320）。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树叶片基因组DNA提取 DNA提取过程详见DNA提取试剂盒说明书，选择材料为C1植株淡绿期叶片，50 μL灭菌蒸馏水洗脱。取2 μL电泳检测提取DNA的质量，确保无明显的蛋白质和RNA残留后，分光光度计测浓度。 1.2.2 TAIL-PCR获得侧翼序列 将获得的C1植株基因组DNA稀释至50 ng/μL，按照Liu等[18]的方法稍加修改，第一轮PCR产物稀释50倍作为第二轮的模板，循环时高温降低2 ℃，dNTP增加至1.6 μL，进行三轮扩增，扩增引物序列与Liu等[18]报道的序列一致，选择清晰条带挖胶，经琼脂糖回收试剂盒回收，与PMDR19-T vector连接，选择至少2个菌液送至华大基因测序，去除连接载体序列后与pCAMBIA2301骨架载体序列进行比较。
1.2.3 侧翼序列验证 根据测序获得的侧翼序列，在pCAMBIA2301载体RB侧的序列和侧翼序列上分别设计一条引物，命名为3C-5F/R，片段大小为810 bp，扩增植株C1和橡胶树无性系热研7-33-97，用来验证获得的侧翼序列是否为目标序列。根据获得的侧翼序列设计前后两对引物，分别命名为3C-5-CY-1F/R和3C-5-CY-2F/R，扩增片段大小分别是808 bp和599 bp，用来扩增植株C1和橡胶树无性系热研7-33-97，获得整个侧翼序列，将上述获得的序列采用LASERGENE 6.0中的Seqman软件去除载体序列后进行拼接，利用MUSLE软件进行序列数据比对[21]，并用GeneDoc软件可视化输出。引物详细序列见表1。
1.2.4 突变体T-DNA插入位点纯合/杂合分析
在pCAMBIA2301载体的T-DNA区域靠近LB序列附近设计一条引物1-6-7-1R，距离LB 258 bp，在已获得的LB处橡胶树基因组序列上设计一条引物1-2F，该引物距离LB处350 bp，另外在已获得的侧翼序列上设计一条引物1-2R，距离获得的侧翼序列开头65 bp。因此，将1-2F/R、1-2F/1-6-7-1R和1-2F/1-2R/1-6-7-1R分别进行扩增，其中1-2F/R在热研7-33-97和杂合突变体中可以扩增出条带，片段大小为415 bp（350 bp+65 bp），T-DNA插入纯合突变体中无扩增产物；1-2F/1-6-7-1R在T-DNA插入突变体中可以扩增出条带，其中突变体片段大小为608 bp（350 bp+258 bp），热研7-33-97中无扩增产物；1-2F/1-2R/1-6-7-1R在纯合突变体中扩增产物片段大小为608 bp（350 bp+258 bp），热研7-33-97扩增产物片段大小为415 bp，在杂合突变中扩增的片段大小分别是415 bp和608 bp。
1.2.5 侧翼序列与橡胶树基因组比对及HbCBF1插入位点分析 将获得的侧翼序列与本单位已获得的橡胶树基因组序列进行比对，获得该序列所在的scafford，并与其左右的基因组序列进行比较，最终确定该插入位点的情况。
2 结果与分析
2.1 HbCBF1转基因阳性植株C1表型性状观察
C1植株定植2个月后，观察表型发现，该植株较对照植株矮化，主要体现在节间距缩小（图1）。
2.2 橡胶树叶片基因组DNA提取及TAIL-PCR侧翼序列的获得
琼脂糖凝胶电泳结果显示，本研究提取的DNA质量较高（图2），可用于PCR分析。利用TAIL-PCR方法获得该植株对应的侧翼序列，经3轮PCR扩增反应，选择清晰的条带进行挖胶回收测序（图3），最终获得1.654 kb的序列（LAD1-1/RB-2a第三轮扩增结果），其中206 bp与pCAMBIA2301载体的RB测得序列一致，因此剩余的1.448 kb为插入基因的序列。
2.3 侧翼序列验证及插入位点纯合/杂合分析
本研究分别利用特异引物进行对扩验证，结果发现，3C-5F/R在热研7-33-97中无扩增产物，植株C1中扩增的序列测序后与TAIL-PCR获得的序列一致（图4），而3C-5-CY-1F/R和3C-5-CY-2F/R扩增热研7-33-97和植株C1测序结果也与TAIL-PCR获得的序列基本一致（图5和图6），因此，笔者认为该序列真实可靠。与此同时，利用载体与侧翼序列的引物进行扩增（图7），1-2F/1-6-7-1R仅在C1中有608 bp的扩增片段，热研7-33-97中无扩增产物；1-2F/R在热研7-33-97和C1中均存在415 bp的片段，可以初步判断该插入位点为杂合；而三引物1-2F/1-2R/1-6-7-1R在热研7-33-97中仅有415 bp的片段，在C1中有2条片段，分别是415 bp和608 bp，因此该T-DNA插入以杂合位点的形式存在。
2.4 HbCBF1插入位点分析
将获得可靠的HBCBF1插入的基因序列与较完善的橡胶树基因组序列进行比对发现，该插入位点距前一个scafford为53.584 kb，而距下一个scafford为4.152 kb，即便是有可能插入后一个基因的启动子处，但是距离ATG前端4 kb处是不可能存在启动子序列的，因此在这段区间内是不可能插入到基因的，其位置参考图8所示。
3 讨论
本研究的实验材料是转HbCBF1基因的阳性橡胶树植株，由CaMV35s启动子驱动该基因的表达，其表现为橡胶树抗寒性未显著提高，但出现植株矮化现象。因在研究CBF/DREB类基因时存在4种不同类型，其中存在抗寒性无明显提高，但伴随矮化的现象[16]，但在转基因研究中，T-DNA的随机插入可能会导致功能基因发生突变，进而发生矮化现象存在。
本研究先获得T-DNA的侧翼序列，然后通过比对获得插入位点的信息，尝试是否由于T-DNA插入功能基因后导致矮化的表型，如果插入功能基因处，那么也存在被插入基因可能导致矮化的可能。笔者通过TAIL-PCR的方法获得T-DNA的侧翼序列，与橡胶树已经获得的全基因组序列比对发现，该插入位置并不存在基因，植株C1又是由CaMV35s启动子驱动HbCBF1获得的，而35s启动子为植物强组成型启动子，它驱动基因在植物不需要的情况下仍强烈表达，改变了植物正常的基因调控和代谢途径，最终影响植物的生长发育，而胁迫诱导型启动子rd29A，只有在植物受到逆境胁迫时才启动基因的表达，因此可减小转基因给植株带来的负面影响[22-23]，因此推测造成矮化的表型并不是由插入位点所在的基因决定的，而是由35s启动子驱动造成的。 早在1998年，Liu等[24]将水稻DREB1A基因转入拟南芥中，发现外源基因的导入并未增强抗性，反而植株出现了矮化。Hsieh等[25]将拟南芥的AtCBF1/DREB1A基因转入番茄，也得到了相同的结果。洪波等[13]将拟南芥AtDREB1A基因以35S或rd29A启动子在菊花中异源表达，与野生型相比，35S：DRBE1A转基因植株在正常生长条件下严重的生长抑制，而rd29A：DREB1A植株生长状况几乎不产生影响，且耐胁迫能力高于前者。韦善军等[26]研究了冷诱导基因的转录因子CBF1对植物抗寒性及生长发育的影响，玉米泛素启动子驱动的CBF1基因增强烟草的抗寒性，但植株矮壮、叶片着生密集，延长营养生长期、推迟花期等。因此在对抗逆相关基因研究时最好采用rd29A等胁迫诱导启动子或其他条件性启动子启动基因的表达，能增强植物抗逆性的同时，避免转化植株出现生长抑制现象[9，27]。不过也有研究认为CBF1的组成型表达对拟南芥植株没有显著影响[28]。
为此笔者尝试利用rd29A启动子启动HbCBF1，观察转基因植株的表型，进而确定启动子对橡胶树矮化性状的影响。目前对CBF/DREB转录因子过量表达可使部分植株明显矮化的机制尚不明确，诸多研究仍处于探索阶段，其机理有待进一步探究。
参考文献
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关键词 HbCBF1；T-DNA；纯合/杂合；矮化；橡胶树
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Abstract The C1 plant transferred HbCBF1 successfully was used as the material， verified by PCR， GUS staining and Southern blot， the phenotype of C1 in the field was dwarf. Using the method of TAIL-PCR， we got the 1.6 Kb flanking sequence of T-DNA， combing with the sequence of vector pCAMBIA2301， we designed three pairs of primers to validate that the sequence was reliable， and judge that the insertion site of T-DNA was heterozygous. Meanwhile， we compared and analyzed the flanking sequence with the genome sequencing result of rubber， and found that there was no gene in the T-DNA insertion site. According to the study of CBF1 and CaMV35s promoter， we speculated that the dwarf phenotype of C1 was induced by the CBF1 gene driven by CaMV35s promoter， instead of the gene of T-DNA insertion.
Key words HbCBF1； T-DNA； Homozygosis / heterozygosis； Dwarf mutant； Hevea brasiliensis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.014
CBF/DREB（C-repeat-binding-factor / dehydration-responsive-element-binding）转录因子作为低温、盐碱胁迫和干旱应答的重要成分，经胁迫诱导后，与下游基因启动子的CRT/DRE（C-repeat / dehydration-responsive-element）元件结合，调节大量含有该元件的抗逆基因表达，从而增强植株对多种逆境的抵抗性[1-2]。但该转录因子在影响植株抗逆性的同时也会影响植株的生长，主要分为以下4种类型，分别是抗逆性提高，伴随矮化[3-5]；抗逆性提高，非矮化[6-7]；抗逆性无明显提高，伴随矮化[8-9]和抗逆性无明显提高，非矮化[10]等。对于矮化的机理方面研究者主要集中在植物激素[11]、启动子[12-13]和外源基因调控相关基因的表达[14-15]等方面，但CBF/DREB转基因植株的矮化可能是由上述某个或某几个因素引起，也有可能有未知因素引起，目前仍没有系统的、确凿的证据阐释矮化机理[16]。
T-DNA插入位点侧翼序列的扩增方法主要有TAIL-PCR法（热不对称交错PCR）、I-PCR法（反向PCR）和Plasmid rescue法（质粒挽救）等，其中TAIL-PCR法是仅使用PCR来扩增侧翼序列的方法，具有简单及高效性，尤其适用于大规模样品未知序列的分离[17-18]。在植物基因组学研究中已建立一套较为完整的、稳定的用于T-DNA插入获得突变体侧翼序列的方法体系[19-20]。
本研究以获得的转HbCBF1阳性植株C1为材料，采用TAIL-PCR的方法成功克隆到该植株T-DNA插入位点的侧翼序列，根据该侧翼序列与橡胶树基因组进行比对，分析插入位点的相关信息，为揭示矮化表型奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
橡胶树转HbCBF1阳性植株C1（CaMV35s启动子启动HbCBF1，表达载体是pCAMBIA2301）和橡胶树无性系热研7-33-97，2011年11月定植于中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃内。
PCR反应所需要的Taq酶购于Fermantas公司，pMDR-19T vector（Takara）、2 kb DNA Ladder和15 kb DNA Ladder和TAIL-PCR用的酶Ex TaqR购于大连宝生物公司。dNTP购于北京全式金生物技术有限公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit购于OMEGA公司。DNA提取试剂盒购于TIANGEN公司（TIANGEN Cat. #DP320）。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树叶片基因组DNA提取 DNA提取过程详见DNA提取试剂盒说明书，选择材料为C1植株淡绿期叶片，50 μL灭菌蒸馏水洗脱。取2 μL电泳检测提取DNA的质量，确保无明显的蛋白质和RNA残留后，分光光度计测浓度。 1.2.2 TAIL-PCR获得侧翼序列 将获得的C1植株基因组DNA稀释至50 ng/μL，按照Liu等[18]的方法稍加修改，第一轮PCR产物稀释50倍作为第二轮的模板，循环时高温降低2 ℃，dNTP增加至1.6 μL，进行三轮扩增，扩增引物序列与Liu等[18]报道的序列一致，选择清晰条带挖胶，经琼脂糖回收试剂盒回收，与PMDR19-T vector连接，选择至少2个菌液送至华大基因测序，去除连接载体序列后与pCAMBIA2301骨架载体序列进行比较。
1.2.3 侧翼序列验证 根据测序获得的侧翼序列，在pCAMBIA2301载体RB侧的序列和侧翼序列上分别设计一条引物，命名为3C-5F/R，片段大小为810 bp，扩增植株C1和橡胶树无性系热研7-33-97，用来验证获得的侧翼序列是否为目标序列。根据获得的侧翼序列设计前后两对引物，分别命名为3C-5-CY-1F/R和3C-5-CY-2F/R，扩增片段大小分别是808 bp和599 bp，用来扩增植株C1和橡胶树无性系热研7-33-97，获得整个侧翼序列，将上述获得的序列采用LASERGENE 6.0中的Seqman软件去除载体序列后进行拼接，利用MUSLE软件进行序列数据比对[21]，并用GeneDoc软件可视化输出。引物详细序列见表1。
1.2.4 突变体T-DNA插入位点纯合/杂合分析
在pCAMBIA2301载体的T-DNA区域靠近LB序列附近设计一条引物1-6-7-1R，距离LB 258 bp，在已获得的LB处橡胶树基因组序列上设计一条引物1-2F，该引物距离LB处350 bp，另外在已获得的侧翼序列上设计一条引物1-2R，距离获得的侧翼序列开头65 bp。因此，将1-2F/R、1-2F/1-6-7-1R和1-2F/1-2R/1-6-7-1R分别进行扩增，其中1-2F/R在热研7-33-97和杂合突变体中可以扩增出条带，片段大小为415 bp（350 bp+65 bp），T-DNA插入纯合突变体中无扩增产物；1-2F/1-6-7-1R在T-DNA插入突变体中可以扩增出条带，其中突变体片段大小为608 bp（350 bp+258 bp），热研7-33-97中无扩增产物；1-2F/1-2R/1-6-7-1R在纯合突变体中扩增产物片段大小为608 bp（350 bp+258 bp），热研7-33-97扩增产物片段大小为415 bp，在杂合突变中扩增的片段大小分别是415 bp和608 bp。
1.2.5 侧翼序列与橡胶树基因组比对及HbCBF1插入位点分析 将获得的侧翼序列与本单位已获得的橡胶树基因组序列进行比对，获得该序列所在的scafford，并与其左右的基因组序列进行比较，最终确定该插入位点的情况。
2 结果与分析
2.1 HbCBF1转基因阳性植株C1表型性状观察
C1植株定植2个月后，观察表型发现，该植株较对照植株矮化，主要体现在节间距缩小（图1）。
2.2 橡胶树叶片基因组DNA提取及TAIL-PCR侧翼序列的获得
琼脂糖凝胶电泳结果显示，本研究提取的DNA质量较高（图2），可用于PCR分析。利用TAIL-PCR方法获得该植株对应的侧翼序列，经3轮PCR扩增反应，选择清晰的条带进行挖胶回收测序（图3），最终获得1.654 kb的序列（LAD1-1/RB-2a第三轮扩增结果），其中206 bp与pCAMBIA2301载体的RB测得序列一致，因此剩余的1.448 kb为插入基因的序列。
2.3 侧翼序列验证及插入位点纯合/杂合分析
本研究分别利用特异引物进行对扩验证，结果发现，3C-5F/R在热研7-33-97中无扩增产物，植株C1中扩增的序列测序后与TAIL-PCR获得的序列一致（图4），而3C-5-CY-1F/R和3C-5-CY-2F/R扩增热研7-33-97和植株C1测序结果也与TAIL-PCR获得的序列基本一致（图5和图6），因此，笔者认为该序列真实可靠。与此同时，利用载体与侧翼序列的引物进行扩增（图7），1-2F/1-6-7-1R仅在C1中有608 bp的扩增片段，热研7-33-97中无扩增产物；1-2F/R在热研7-33-97和C1中均存在415 bp的片段，可以初步判断该插入位点为杂合；而三引物1-2F/1-2R/1-6-7-1R在热研7-33-97中仅有415 bp的片段，在C1中有2条片段，分别是415 bp和608 bp，因此该T-DNA插入以杂合位点的形式存在。
2.4 HbCBF1插入位点分析
将获得可靠的HBCBF1插入的基因序列与较完善的橡胶树基因组序列进行比对发现，该插入位点距前一个scafford为53.584 kb，而距下一个scafford为4.152 kb，即便是有可能插入后一个基因的启动子处，但是距离ATG前端4 kb处是不可能存在启动子序列的，因此在这段区间内是不可能插入到基因的，其位置参考图8所示。
3 讨论
本研究的实验材料是转HbCBF1基因的阳性橡胶树植株，由CaMV35s启动子驱动该基因的表达，其表现为橡胶树抗寒性未显著提高，但出现植株矮化现象。因在研究CBF/DREB类基因时存在4种不同类型，其中存在抗寒性无明显提高，但伴随矮化的现象[16]，但在转基因研究中，T-DNA的随机插入可能会导致功能基因发生突变，进而发生矮化现象存在。
本研究先获得T-DNA的侧翼序列，然后通过比对获得插入位点的信息，尝试是否由于T-DNA插入功能基因后导致矮化的表型，如果插入功能基因处，那么也存在被插入基因可能导致矮化的可能。笔者通过TAIL-PCR的方法获得T-DNA的侧翼序列，与橡胶树已经获得的全基因组序列比对发现，该插入位置并不存在基因，植株C1又是由CaMV35s启动子驱动HbCBF1获得的，而35s启动子为植物强组成型启动子，它驱动基因在植物不需要的情况下仍强烈表达，改变了植物正常的基因调控和代谢途径，最终影响植物的生长发育，而胁迫诱导型启动子rd29A，只有在植物受到逆境胁迫时才启动基因的表达，因此可减小转基因给植株带来的负面影响[22-23]，因此推测造成矮化的表型并不是由插入位点所在的基因决定的，而是由35s启动子驱动造成的。 早在1998年，Liu等[24]将水稻DREB1A基因转入拟南芥中，发现外源基因的导入并未增强抗性，反而植株出现了矮化。Hsieh等[25]将拟南芥的AtCBF1/DREB1A基因转入番茄，也得到了相同的结果。洪波等[13]将拟南芥AtDREB1A基因以35S或rd29A启动子在菊花中异源表达，与野生型相比，35S：DRBE1A转基因植株在正常生长条件下严重的生长抑制，而rd29A：DREB1A植株生长状况几乎不产生影响，且耐胁迫能力高于前者。韦善军等[26]研究了冷诱导基因的转录因子CBF1对植物抗寒性及生长发育的影响，玉米泛素启动子驱动的CBF1基因增强烟草的抗寒性，但植株矮壮、叶片着生密集，延长营养生长期、推迟花期等。因此在对抗逆相关基因研究时最好采用rd29A等胁迫诱导启动子或其他条件性启动子启动基因的表达，能增强植物抗逆性的同时，避免转化植株出现生长抑制现象[9，27]。不过也有研究认为CBF1的组成型表达对拟南芥植株没有显著影响[28]。
为此笔者尝试利用rd29A启动子启动HbCBF1，观察转基因植株的表型，进而确定启动子对橡胶树矮化性状的影响。目前对CBF/DREB转录因子过量表达可使部分植株明显矮化的机制尚不明确，诸多研究仍处于探索阶段，其机理有待进一步探究。
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