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摘 要：為探究不同包装方式下羊肉冷藏过程中热休克蛋白27（Hsp27）、热休克蛋白70（Hsp70）表达量的变化及其与羊肉品质间的关系，以宰后1 h羊背最长肌为研究对象，进行托盘、真空、高氧气调（O2、CO2体积比75︰25）和低氧气调（O2、CO2体积比50︰50）包装，分析Hsp27和Hsp70表达量、pH值、色泽、剪切力和蒸煮损失率的变化，并进行Hsp27、Hsp70表达量与肉品质的相关性分析。结果表明：在贮藏后期（144 h），真空包装处理组的亮度值（L*）和红度值（a*）明显高于托盘包装和气调包装组，剪切力显著低于托盘包装和气调包装组;随着贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉贮藏过程中Hsp27相对表达量呈先增加后降低趋势，Hsp70相对表达量呈逐渐上升趋势;Hsp27相对表达量与pH值、剪切力呈正相关，与L*、a*、b*和蒸煮损失率呈负相关;Hsp70相对表达量与pH值、剪切力呈负相关，与L*、a*、b*和蒸煮损失率呈正相关。本研究证明了Hsp27相对表达量上调、Hsp70相对表达量下调可提高羊肉的色泽和嫩度，且真空包装处理组羊肉保鲜效果最好。因此，Hsp27、Hsp70可作为羊肉的生物标志物，为羊肉品质评价提供参考依据。
关键词：羊肉;品质;包装方式;热休克蛋白27;热休克蛋白70
Effect of Packaging on Expression of Heat Shock Proteins and Meat Quality in Lambs during Refrigeration Storage
MA Huimin1，2， WANG Zhenyu2， HUANG Caiyan2， ZHAO Yingxin2， ZHANG Dequan1，2，*
（1.School of Food and Wine， Ningxia University， Yinchuan 750021， China; 2.Key Laboratory of Agro-Products Quality and Safety Harvest， Storage， Transportation， Management and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Food Science and Technology， China Academy of Agricultural Science， Beijing 100193， China）
Abstract： The objective of this study was to explore changes in the expression of heat shock protein 27 （Hsp27） and 70 （Hsp70） in lamb meat packaged in different ways during refrigeration storage and to investigate their relationship with meat quality. At 1 h postmortem， the longissimus dorsi muscles were subjected to air packaging， vacuum packaging， high-oxygen modified atmosphere packaging （O2：CO2 = 75：25， V/V） or low-oxygen modified atmosphere packaging （O2：CO2 = 50：50， V/V）. Changes in the expression of Hsp27 and Hsp70， pH， color， shear force and cooking loss were analyzed during subsequent storage. The results showed that after 144 h of storage， the L* and a* values of the vacuum packaging group were significantly higher than those of the air packaging and modified atmosphere packaging groups， whereas the shear force value was significantly lower than that of the air packaging and modified atmosphere packaging groups. For all packaging groups， the relative expression of Hsp27 increased at the beginning of storage and then decreased， while the relative expression of Hsp70 increased gradually during the whole storage period. The relative expression of Hsp27 was positively correlated with pH value and shear force， but negatively correlated with L*， a* and b* values and cooking loss; the relative expression of Hsp70 was negatively correlated with pH value and shear force， but positively correlated with L*， a* and b* values and cooking loss. This study proved that the up-regulated relative expression of Hsp27 and the down-regulated relative expression of Hsp70 could improve the color and tenderness of lamb meat， and the vacuum packaging group showed the best preservation effect. Therefore， Hsp27 and Hsp70 can be considered as biomarkers for lamb quality evaluation. Keywords： lamb; quality; packaging method; heat shock protein 27; heat shock protein 70
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：
引文格式：
马惠敏， 王振宇， 黄彩燕， 等. 包装对羊肉冷藏过程中热休克蛋白表达及羊肉品质的影响[J]. 肉类研究， 2021， 35（3）： . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033. http：//www.rlyj.net.cn
MA Huimin， WANG Zhenyu， HUANG Caiyan， et al. Effect of packaging on expression of heat shock proteins and meat quality in lambs during refrigeration storage[J]. Meat Research， 2021， 35（3）： . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033. http：//www.rlyj.net.cn
羊肉风味浓郁、肉质细嫩、味道鲜美，具有高蛋白质、低脂肪、低胆固醇等特点，且富含人体所必需的氨基酸和微量元素，营养价值高，深受消费者喜爱[1-2]。食用品质是评价羊肉品质优劣的关键指标之一，会直接影响消费者的购买决定和产业经济效益，其主要包括嫩度、色泽、风味和多汁性[3]。因此，羊肉品质的精准保持和快速鉴别是肉类产业需求的重点和肉品科学的研究热点。
采用新型包装技术是保证羊肉品质的重要手段，也是改善羊肉品质的重要突破[4]，其中托盘包装、真空包装和气调包装是目前产业中常用的主要包装方式[5]。目前羊肉的鉴别方法有近红外光谱、高光谱、拉曼光谱等技术，这些技术具有能够实现快速检测、无损耗、样品无需前处理等优点，但其检测精度较低、稳定性差，易受环境因素的影响[6]。
近年来，随着分子生物学理论和组学技术的迅速发展，利用组学技术挖掘表征肉品质生物标志物成为肉品领域的研究热点，这为鉴别、评价和预测肉品质开辟了新思路[7-8]。热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是动物中广泛存在的一类高度保守蛋白，通常按分子质量大小可分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60及小分子蛋白（Hsp20、Hsp27、αB-晶体蛋白）[9]。Hsp具有分子伴侣、抑制应激诱导的细胞凋亡和维持肌原纤维结构稳定的生物学功能，对肉品质具有重要影响。Hwang等[10]研究发现，Hsp27表达量与猪肉的韧性呈正相关。Kim等[11]研究发现，Hsp27表达量与牛肉的韧性呈正相关，与亮度值（L*）和红度值（a*）呈负相关。Carvalho等[12]研究印度诺尔牛发现，Hsp70表达量增加，牛肉剪切力增大。Zhang Muhan等[13]研究鹅肉发现，Hsp70在低滴水损失组有较高的表达，并被认为是肉中持水力的潜在预测因子。Luca等[14]研究表明，随着Hsp70表达量的升高，猪肉滴水损失降低。但目前有关Hsp27、Hsp70在羊肉中的研究报道还很少，Hsp27、Hsp70能否作为表征羊肉品质的潜在生物标志物有待进一步研究，不同包装方式是否会影响宰后羊肉冷藏过程中Hsp27、Hsp70表达量变化尚不清楚。
本研究以羊背最长肌为研究对象，探究不同包装方式下羊肉冷藏过程中Hsp27、Hsp70相对表达量的变化及其与肉品质间的关系，明确包装方式对Hsp27、Hsp70的影响规律，为羊肉品质评价和鉴别提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊肉采集于内蒙古美洋洋食品有限公司。选取20 只6～8 月龄、饲养环境一致的小尾寒羊公羊。Hsp27小鼠单克隆抗体G3.1（ab2790）、Hsp70小鼠单克隆抗体3A3（ab5439）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（ab205719） 英国Abcam公司;GAPDH鼠单克隆抗体（AB-M-M001） 杭州贤至生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电泳设备、转膜设备、ChemiDocTM MP凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司;CM-600D色差计 日本柯尼卡-美能达（中国）有限公司;数显式肌肉嫩度仪 东北农业大学工程学院;Testo 205便携式pH计 德国德图公司;RDW550P卧式气调包装机（全自动） 成都市罗斯波尔机械有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 江苏省荣华仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理及实验设计
采用完全隨机法将20 只小尾寒羊公羊分成4 组，每组5 只，分别用于托盘包装、真空包装、高氧气调包装（O2、CO2体积比75︰25）和低氧气调包装（O2、CO2体积比50︰50）。托盘包装采用聚丙烯托盘，真空包装袋厚度150 μm，透氧性4 cm3/（m2·d），透湿性4.5 g/（m2·d），气调包装膜厚度100 μm，透氧性<2 cm3/（m2·d），透湿性<5 g/（m2·d）。小尾寒羊屠宰后30 min内取双侧背最长肌，置于4 ℃冷库15 min内剔除表面筋膜及结缔组织，每组样品分成大小相等的6 份，在宰后1 h对样品进行包装，随后将包装的样品置于4 ℃冰箱中冷藏，分别在冷藏1、6、12、24、72、144 h时测定pH值、肉色、蒸煮损失率、剪切力并留样。留样样品于冻存管中液氮速冻后置于干冰中带回实验室，用于Hsp27和Hsp70相对表达量测定。 1.3.2 pH值的测定
参考Szerman等[15]方法，使用便携式pH计测定各时间点肉样的pH值，将探头插入羊肉中，深度约2 cm，选取3 个不同位置连续测定3 次，结果取平均值。
1.3.3 肉色的测定
参考李蒙[16]方法，用CM-600D色差计测定L*、a*、黄度值（b*），色差计在使用前用标准白瓷板和标准黑板在室温下进行校正，每个样品表面选取4 个位点进行测定，结果取平均值。
1.3.4 剪切力的测定
参考李桂霞等[17]的方法，稍作修改。将肉样置于蒸煮袋内，抽去袋内空气，使肉块表面紧贴蒸煮袋，密封袋口，放入71 ℃水浴锅中30 min后将肉块取出，冷却至室温并放入4 ℃冰箱过夜。将肉样沿着肌纤维方向切成1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm的小块。采用数显式肌肉嫩度仪对样品进行测定，每个样品重复测定7 次，结果取平均值。
1.3.5 蒸煮损失率的测定
参考肖雄等[18]的方法，稍作修改。称取肉样，质量记为m1（g），随后将肉样放置于蒸煮袋内并抽去袋内空气，使肉块表面紧贴蒸煮袋，密封袋口，放入71 ℃水浴锅中30 min后将肉块取出，冷却至室温用定性滤纸擦去表面水分后称质量，记为m2（g）。蒸煮损失率按照下式计算。
1.3.6 Hsp免疫印迹
肌浆蛋白的提取：参考Huang[19]、Oh[20]等的方法并稍作修改，称取1 g冷冻的肉样，加入6 mL预冷的缓冲液（0.01 mol/L Tris、0.01 mol/L二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、pH 8.3、蛋白酶抑制剂1 片（配制50 mL））冰浴匀浆，然后在4 ℃条件下10 000×g离心30 min，上清液即为肌浆蛋白溶液。肌浆蛋白溶液用超纯水稀释20 倍后，用BCA试剂盒测定蛋白质质量浓度，将肌浆蛋白质量浓度调至8 mg/mL，保存于-80 ℃备用。
免疫印迹：参考Shi[21]、Xing[22]、Xing Tong[23]等的方法并稍作修改。提取的肌浆蛋白样品调整质量浓度为8 mg/mL，按体积比1︰1加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（10 g/100 mL SDS、10 mL甘油、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1 mol/L DTT、1 mol/L溴酚蓝），沸水浴中加热10 min，蛋白上样量为10 L。SDS-PAGE电泳中Hsp27和Hsp70采用12%的分离胶和4%的浓缩胶，电泳初始电压为70 V，待蛋白进入分离胶后将电压调整为110 V，待蛋白到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后采用湿法将凝胶上的蛋白条带转移在硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上，转膜结束后用TBST缓冲液（137 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris、体积分数0.1% 吐温-20、pH 7.6）清洗NC膜3 次，每次10 min。清洗后将条带置于含5 g/100 mL脱脂乳粉的TBST溶液中室温封闭1 h，加入一抗（Hsp27小鼠单克隆抗体（稀释比1︰200）、Hsp70小鼠单克隆抗体（稀释比1︰1 000）和GAPDH鼠单克隆抗体（稀释比1︰500）），4 ℃缓慢摇动孵育过夜，随后用TBST溶液漂洗NC膜3 次，每次10 min。漂洗后加入二抗（稀释比1︰2 000），室温缓慢摇动孵育2 h;孵育结束后用TBST溶液漂洗NC膜3 次，加入电化学发光显色液浸泡5 min，凝胶成像仪拍照。采用Quantity One软件分析条带灰度值。
1.4 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2010软件进行数据分析与作图。利用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行差异显著性分析，采用邓肯多重比较法，P<0.05即为差异显著，所得结果以平均值±标准差的形式表示。
2 结果与分析
2.1 不同包装方式处理羊肉冷藏过程中Hsp27的相对表达量变化
由图1可知，随着贮藏时间的延长，不同包装方式处理下Hsp27条带灰度值减小，表明Hsp27发生降解，尤其是在宰后72、144 h，Hsp27的降解程度明显高于宰后初期。
小写字母不同，表示同一包装方式、不同贮藏时间差异显著（P<0.05）;大写字母不同，表示同一贮藏时间、不同包装方式差异显著（P<0.05）。图4同。
由图2可知，随着宰后贮藏时间延长，不同包装方式羊肉冷藏过程中Hsp27相对表达量呈先增加后降低趋势，其中真空包装和低氧气调包装羊肉Hsp27相对表达量在宰后6 h达到峰值，托盘包装和高氧气调包装在宰后12 h達到峰值。宰后初期羊刚被屠宰放血，处于缺氧状态，外界氧气和营养供应的终止导致细胞产生不可避免的凋亡，Hsp27作为一种应激蛋白立即对细胞凋亡产生应激反应，以维持细胞的平衡。李捷等[24]的研究结果表明，Hsp27表达量总体呈降低趋势，这与本研究结果一致。宰后贮藏后期Hsp27相对表达量下降，原因可能是Hsp27作为分子伴侣，结合受损的蛋白质以及错误折叠的蛋白质保护细胞内蛋白，防止不可逆的损伤[25]，最终导致机体Hsp27相对表达量降低。
2.2 不同包装方式处理羊肉冷藏过程中Hsp70的相对表达量变化
由图3可知，随贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉Hsp70条带灰度值逐渐增加，尤其是在宰后144 h，Hsp70的条带明显深于宰后初期。 由图4可知，不同包装方式羊肉冷藏过程中Hsp70相对表达量呈逐渐上升趋势，在144 h达到峰值。在冷藏后期的24、72、144 h，高氧气调包装组Hsp70相对表达量明显高于托盘包装、真空包装和低氧气调包装组。4 种包装方式羊肉冷藏过程中Hsp70相对表达量逐渐上升，可能是由于Hsp70可以抑制细胞凋亡进程，保护组织免受氧化应激损伤[26-27]。冷藏24～144 h，高氧气调包装组Hsp70相对表达量明显高于其他3 个处理组，出现这种现象的原因可能是高氧环境可能会引起肉品发生氧化应激反应，从而促使Hsp70表达量上调，来保护机体免受氧化损伤。杨啸吟等[28]研究结果表明，高氧环境可能会促使抗氧化蛋白2、Hsp及DJ-1蛋白的表达量上调，以抵御肉品的氧化应激反应，这与本研究结果一致。
2.3 不同包装方式处理羊肉冷藏过程中品质的变化
由表1可知，随着贮藏时间的延长，4 种不同包装方式羊肉pH值逐渐下降，从宰后1 h的6.86显著下降到宰后72 h的5.8左右（P<0.05），72 h后趋于稳定。a*和L*是衡量肉类新鲜度最重要的颜色参数，真空包装处理组贮藏至144 h的L*和a*明显高于托盘包装和气调包装处理组，说明真空包装处理组羊肉的L*和a*最好，在贮藏至144 h仍能保持較好的色泽，本研究结果与董玉影[29]、Maqsood[30]等研究结果一致。随着贮藏时间的延长，不同包装方式处理组b*呈上升趋势，但是在不同包装之间无显著差异。
随着贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉剪切力呈先升高后降低的趋势。宰后后期24～144 h，高氧气调包装组剪切力显著高于托盘包装、低氧气调包装和真空包装组（P<0.05），说明真空包装处理组嫩度最好，原因可能是Hsp27表达量的下调增加了肌动蛋白的降解，肌肉中肌原纤维完整性衰减和内部Z线和I带连接处被破坏，从而导致肌原纤维超微结构发生变化，肉嫩度提高[31]。在冷藏后期72～144 h，真空包装处理组剪切力明显低于其他3 个处理组（P<0.05），在此期间Hsp70相对表达量也明显低于其他3 个处理组，推测真空包装处理组肉嫩度降低可能与Hsp70表达量有关。
持水能力是肉类加工的重要性能，羊肉蒸煮损失率是衡量肌肉持水能力的重要指标。随着贮藏时间的延长，除宰后1 h外不同包装方式羊肉蒸煮损失率总体呈先增加后降低的趋势，表明不同包装方式羊肉的持水能力随着时间的延长而降低;宰后6 h和12 h，真空包装处理组蒸煮损失率低于托盘包装、高氧气调包装和低氧气调包装，说明真空包装处理组羊肉持水能力较好。但是蒸煮损失率在不同包装之间差异不显著，证实了不同包装对蒸煮损失率没有显著影响，本研究结果与朱学伸等[32]研究一致。在宰后6 h，真空包装处理组蒸煮损失率明显低于托盘包装和气调包装处理组（P<0.05），此时真空包装处理组Hsp27、Hsp70相对表达量显著高于其他3 个处理组，原因可能是Hsp27、Hsp70表达量上调抑制了肌肉细胞凋亡，减少膜破裂和细胞内水分流失，使肉的保水能力增强。
2.4 不同包装方式下羊肉Hsp27、Hsp70表达量与pH值、肉色、剪切力和蒸煮损失率相关性分析
图中左下方数字表示各指标之间的相关系数，右上方圆圈表示各指标间的相关强度，圆圈越大表示相关性越强，蓝色表示负相关，红色表示正相关;*.相关性显著（P<0.05），**.相关性极显著（P<0.01）。
对不同包装方式羊肉冷藏1～144 h Hsp27和Hsp70相对表达量及品质进行相关性分析，可进一步明确这2 种潜在标志物与各品质的相关程度。由图5可知：Hsp27相对表达量与pH值呈显著正相关（P<0.05），相关系数为0.477，与剪切力呈正相关，与L*、b*和蒸煮损失率呈极显著负相关（P<0.01），相关系数分别为-0.632、-0.677和-0.723，与a*呈显著负相关（P<0.05），相关系数为-0.486;Hsp70相对表达量与pH值呈极显著负相关（P<0.01），相关系数为-0.565，与剪切力呈负相关，与L*、a*、b*呈极显著正相关（P<0.01），相关系数分别为0.608、0.592和0.804;与蒸煮损失率呈显著正相关（P<0.05），相关系数为0.436。
本研究中Hsp27相对表达量与pH值呈显著正相关与其他研究基本一致[24，33]，与肉色（L*、b*）呈极显著负相关，与a*呈显著负相关与Kim[11]、张淼[34]等的研究结果一致。蛋白质组学的研究结果中关于Hsp27与嫩度的关系并不一致，其中Ding Zhenjiang等[35]研究发现，Hsp27表达量与牛肉的韧性呈负相关，Huang Honggang等[19]研究发现，猪肉中Hsp27表达量与韧性呈正相关，本研究结果与Huang Honggang等[19]的研究结果一致。本研究中Hsp70相对表达量与pH值呈极显著负相关，与L*、a*、b*呈极显著正相关，这与Gagaoua等[7]研究结果一致。Hsp70相对表达量与剪切力呈负相关，Guillemin等[27]研究表明，Hsp70相对表达量与牛肉嫩度呈负相关，这与本研究结果一致。
3 结 论
随着贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉的pH值逐渐降低;在贮藏后期（144 h），真空包装处理组的L*和a*明显高于托盘包装和气调包装，剪切力显著低于托盘包装和气调包装。随着贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉贮藏过程中Hsp27相对表达量呈先增加后降低趋势，Hsp70相对表达量呈逐渐上升趋势。Hsp27和Hsp70与羊肉品质的相关关系如下：Hsp27相对表达量与pH值、剪切力呈正相关，与L*、a*、b*和蒸煮损失率呈负相关;Hsp70相对表达量与pH值、剪切力呈负相关，与L*、a*、b*和蒸煮损失率呈正相关。本研究表明，Hsp27相对表达量上调、Hsp70相对表达量下调可提高羊肉的色泽和嫩度，且真空包装处理组羊肉保鲜效果最好。 参考文献：
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关键词：羊肉;品质;包装方式;热休克蛋白27;热休克蛋白70
Effect of Packaging on Expression of Heat Shock Proteins and Meat Quality in Lambs during Refrigeration Storage
MA Huimin1，2， WANG Zhenyu2， HUANG Caiyan2， ZHAO Yingxin2， ZHANG Dequan1，2，*
（1.School of Food and Wine， Ningxia University， Yinchuan 750021， China; 2.Key Laboratory of Agro-Products Quality and Safety Harvest， Storage， Transportation， Management and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Food Science and Technology， China Academy of Agricultural Science， Beijing 100193， China）
Abstract： The objective of this study was to explore changes in the expression of heat shock protein 27 （Hsp27） and 70 （Hsp70） in lamb meat packaged in different ways during refrigeration storage and to investigate their relationship with meat quality. At 1 h postmortem， the longissimus dorsi muscles were subjected to air packaging， vacuum packaging， high-oxygen modified atmosphere packaging （O2：CO2 = 75：25， V/V） or low-oxygen modified atmosphere packaging （O2：CO2 = 50：50， V/V）. Changes in the expression of Hsp27 and Hsp70， pH， color， shear force and cooking loss were analyzed during subsequent storage. The results showed that after 144 h of storage， the L* and a* values of the vacuum packaging group were significantly higher than those of the air packaging and modified atmosphere packaging groups， whereas the shear force value was significantly lower than that of the air packaging and modified atmosphere packaging groups. For all packaging groups， the relative expression of Hsp27 increased at the beginning of storage and then decreased， while the relative expression of Hsp70 increased gradually during the whole storage period. The relative expression of Hsp27 was positively correlated with pH value and shear force， but negatively correlated with L*， a* and b* values and cooking loss; the relative expression of Hsp70 was negatively correlated with pH value and shear force， but positively correlated with L*， a* and b* values and cooking loss. This study proved that the up-regulated relative expression of Hsp27 and the down-regulated relative expression of Hsp70 could improve the color and tenderness of lamb meat， and the vacuum packaging group showed the best preservation effect. Therefore， Hsp27 and Hsp70 can be considered as biomarkers for lamb quality evaluation. Keywords： lamb; quality; packaging method; heat shock protein 27; heat shock protein 70
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：
引文格式：
马惠敏， 王振宇， 黄彩燕， 等. 包装对羊肉冷藏过程中热休克蛋白表达及羊肉品质的影响[J]. 肉类研究， 2021， 35（3）： . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033. http：//www.rlyj.net.cn
MA Huimin， WANG Zhenyu， HUANG Caiyan， et al. Effect of packaging on expression of heat shock proteins and meat quality in lambs during refrigeration storage[J]. Meat Research， 2021， 35（3）： . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210208-033. http：//www.rlyj.net.cn
羊肉风味浓郁、肉质细嫩、味道鲜美，具有高蛋白质、低脂肪、低胆固醇等特点，且富含人体所必需的氨基酸和微量元素，营养价值高，深受消费者喜爱[1-2]。食用品质是评价羊肉品质优劣的关键指标之一，会直接影响消费者的购买决定和产业经济效益，其主要包括嫩度、色泽、风味和多汁性[3]。因此，羊肉品质的精准保持和快速鉴别是肉类产业需求的重点和肉品科学的研究热点。
采用新型包装技术是保证羊肉品质的重要手段，也是改善羊肉品质的重要突破[4]，其中托盘包装、真空包装和气调包装是目前产业中常用的主要包装方式[5]。目前羊肉的鉴别方法有近红外光谱、高光谱、拉曼光谱等技术，这些技术具有能够实现快速检测、无损耗、样品无需前处理等优点，但其检测精度较低、稳定性差，易受环境因素的影响[6]。
近年来，随着分子生物学理论和组学技术的迅速发展，利用组学技术挖掘表征肉品质生物标志物成为肉品领域的研究热点，这为鉴别、评价和预测肉品质开辟了新思路[7-8]。热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是动物中广泛存在的一类高度保守蛋白，通常按分子质量大小可分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60及小分子蛋白（Hsp20、Hsp27、αB-晶体蛋白）[9]。Hsp具有分子伴侣、抑制应激诱导的细胞凋亡和维持肌原纤维结构稳定的生物学功能，对肉品质具有重要影响。Hwang等[10]研究发现，Hsp27表达量与猪肉的韧性呈正相关。Kim等[11]研究发现，Hsp27表达量与牛肉的韧性呈正相关，与亮度值（L*）和红度值（a*）呈负相关。Carvalho等[12]研究印度诺尔牛发现，Hsp70表达量增加，牛肉剪切力增大。Zhang Muhan等[13]研究鹅肉发现，Hsp70在低滴水损失组有较高的表达，并被认为是肉中持水力的潜在预测因子。Luca等[14]研究表明，随着Hsp70表达量的升高，猪肉滴水损失降低。但目前有关Hsp27、Hsp70在羊肉中的研究报道还很少，Hsp27、Hsp70能否作为表征羊肉品质的潜在生物标志物有待进一步研究，不同包装方式是否会影响宰后羊肉冷藏过程中Hsp27、Hsp70表达量变化尚不清楚。
本研究以羊背最长肌为研究对象，探究不同包装方式下羊肉冷藏过程中Hsp27、Hsp70相对表达量的变化及其与肉品质间的关系，明确包装方式对Hsp27、Hsp70的影响规律，为羊肉品质评价和鉴别提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊肉采集于内蒙古美洋洋食品有限公司。选取20 只6～8 月龄、饲养环境一致的小尾寒羊公羊。Hsp27小鼠单克隆抗体G3.1（ab2790）、Hsp70小鼠单克隆抗体3A3（ab5439）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（ab205719） 英国Abcam公司;GAPDH鼠单克隆抗体（AB-M-M001） 杭州贤至生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电泳设备、转膜设备、ChemiDocTM MP凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司;CM-600D色差计 日本柯尼卡-美能达（中国）有限公司;数显式肌肉嫩度仪 东北农业大学工程学院;Testo 205便携式pH计 德国德图公司;RDW550P卧式气调包装机（全自动） 成都市罗斯波尔机械有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 江苏省荣华仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理及实验设计
采用完全隨机法将20 只小尾寒羊公羊分成4 组，每组5 只，分别用于托盘包装、真空包装、高氧气调包装（O2、CO2体积比75︰25）和低氧气调包装（O2、CO2体积比50︰50）。托盘包装采用聚丙烯托盘，真空包装袋厚度150 μm，透氧性4 cm3/（m2·d），透湿性4.5 g/（m2·d），气调包装膜厚度100 μm，透氧性<2 cm3/（m2·d），透湿性<5 g/（m2·d）。小尾寒羊屠宰后30 min内取双侧背最长肌，置于4 ℃冷库15 min内剔除表面筋膜及结缔组织，每组样品分成大小相等的6 份，在宰后1 h对样品进行包装，随后将包装的样品置于4 ℃冰箱中冷藏，分别在冷藏1、6、12、24、72、144 h时测定pH值、肉色、蒸煮损失率、剪切力并留样。留样样品于冻存管中液氮速冻后置于干冰中带回实验室，用于Hsp27和Hsp70相对表达量测定。 1.3.2 pH值的测定
参考Szerman等[15]方法，使用便携式pH计测定各时间点肉样的pH值，将探头插入羊肉中，深度约2 cm，选取3 个不同位置连续测定3 次，结果取平均值。
1.3.3 肉色的测定
参考李蒙[16]方法，用CM-600D色差计测定L*、a*、黄度值（b*），色差计在使用前用标准白瓷板和标准黑板在室温下进行校正，每个样品表面选取4 个位点进行测定，结果取平均值。
1.3.4 剪切力的测定
参考李桂霞等[17]的方法，稍作修改。将肉样置于蒸煮袋内，抽去袋内空气，使肉块表面紧贴蒸煮袋，密封袋口，放入71 ℃水浴锅中30 min后将肉块取出，冷却至室温并放入4 ℃冰箱过夜。将肉样沿着肌纤维方向切成1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm的小块。采用数显式肌肉嫩度仪对样品进行测定，每个样品重复测定7 次，结果取平均值。
1.3.5 蒸煮损失率的测定
参考肖雄等[18]的方法，稍作修改。称取肉样，质量记为m1（g），随后将肉样放置于蒸煮袋内并抽去袋内空气，使肉块表面紧贴蒸煮袋，密封袋口，放入71 ℃水浴锅中30 min后将肉块取出，冷却至室温用定性滤纸擦去表面水分后称质量，记为m2（g）。蒸煮损失率按照下式计算。
1.3.6 Hsp免疫印迹
肌浆蛋白的提取：参考Huang[19]、Oh[20]等的方法并稍作修改，称取1 g冷冻的肉样，加入6 mL预冷的缓冲液（0.01 mol/L Tris、0.01 mol/L二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、pH 8.3、蛋白酶抑制剂1 片（配制50 mL））冰浴匀浆，然后在4 ℃条件下10 000×g离心30 min，上清液即为肌浆蛋白溶液。肌浆蛋白溶液用超纯水稀释20 倍后，用BCA试剂盒测定蛋白质质量浓度，将肌浆蛋白质量浓度调至8 mg/mL，保存于-80 ℃备用。
免疫印迹：参考Shi[21]、Xing[22]、Xing Tong[23]等的方法并稍作修改。提取的肌浆蛋白样品调整质量浓度为8 mg/mL，按体积比1︰1加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（10 g/100 mL SDS、10 mL甘油、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1 mol/L DTT、1 mol/L溴酚蓝），沸水浴中加热10 min，蛋白上样量为10 L。SDS-PAGE电泳中Hsp27和Hsp70采用12%的分离胶和4%的浓缩胶，电泳初始电压为70 V，待蛋白进入分离胶后将电压调整为110 V，待蛋白到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后采用湿法将凝胶上的蛋白条带转移在硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上，转膜结束后用TBST缓冲液（137 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris、体积分数0.1% 吐温-20、pH 7.6）清洗NC膜3 次，每次10 min。清洗后将条带置于含5 g/100 mL脱脂乳粉的TBST溶液中室温封闭1 h，加入一抗（Hsp27小鼠单克隆抗体（稀释比1︰200）、Hsp70小鼠单克隆抗体（稀释比1︰1 000）和GAPDH鼠单克隆抗体（稀释比1︰500）），4 ℃缓慢摇动孵育过夜，随后用TBST溶液漂洗NC膜3 次，每次10 min。漂洗后加入二抗（稀释比1︰2 000），室温缓慢摇动孵育2 h;孵育结束后用TBST溶液漂洗NC膜3 次，加入电化学发光显色液浸泡5 min，凝胶成像仪拍照。采用Quantity One软件分析条带灰度值。
1.4 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2010软件进行数据分析与作图。利用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行差异显著性分析，采用邓肯多重比较法，P<0.05即为差异显著，所得结果以平均值±标准差的形式表示。
2 结果与分析
2.1 不同包装方式处理羊肉冷藏过程中Hsp27的相对表达量变化
由图1可知，随着贮藏时间的延长，不同包装方式处理下Hsp27条带灰度值减小，表明Hsp27发生降解，尤其是在宰后72、144 h，Hsp27的降解程度明显高于宰后初期。
小写字母不同，表示同一包装方式、不同贮藏时间差异显著（P<0.05）;大写字母不同，表示同一贮藏时间、不同包装方式差异显著（P<0.05）。图4同。
由图2可知，随着宰后贮藏时间延长，不同包装方式羊肉冷藏过程中Hsp27相对表达量呈先增加后降低趋势，其中真空包装和低氧气调包装羊肉Hsp27相对表达量在宰后6 h达到峰值，托盘包装和高氧气调包装在宰后12 h達到峰值。宰后初期羊刚被屠宰放血，处于缺氧状态，外界氧气和营养供应的终止导致细胞产生不可避免的凋亡，Hsp27作为一种应激蛋白立即对细胞凋亡产生应激反应，以维持细胞的平衡。李捷等[24]的研究结果表明，Hsp27表达量总体呈降低趋势，这与本研究结果一致。宰后贮藏后期Hsp27相对表达量下降，原因可能是Hsp27作为分子伴侣，结合受损的蛋白质以及错误折叠的蛋白质保护细胞内蛋白，防止不可逆的损伤[25]，最终导致机体Hsp27相对表达量降低。
2.2 不同包装方式处理羊肉冷藏过程中Hsp70的相对表达量变化
由图3可知，随贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉Hsp70条带灰度值逐渐增加，尤其是在宰后144 h，Hsp70的条带明显深于宰后初期。 由图4可知，不同包装方式羊肉冷藏过程中Hsp70相对表达量呈逐渐上升趋势，在144 h达到峰值。在冷藏后期的24、72、144 h，高氧气调包装组Hsp70相对表达量明显高于托盘包装、真空包装和低氧气调包装组。4 种包装方式羊肉冷藏过程中Hsp70相对表达量逐渐上升，可能是由于Hsp70可以抑制细胞凋亡进程，保护组织免受氧化应激损伤[26-27]。冷藏24～144 h，高氧气调包装组Hsp70相对表达量明显高于其他3 个处理组，出现这种现象的原因可能是高氧环境可能会引起肉品发生氧化应激反应，从而促使Hsp70表达量上调，来保护机体免受氧化损伤。杨啸吟等[28]研究结果表明，高氧环境可能会促使抗氧化蛋白2、Hsp及DJ-1蛋白的表达量上调，以抵御肉品的氧化应激反应，这与本研究结果一致。
2.3 不同包装方式处理羊肉冷藏过程中品质的变化
由表1可知，随着贮藏时间的延长，4 种不同包装方式羊肉pH值逐渐下降，从宰后1 h的6.86显著下降到宰后72 h的5.8左右（P<0.05），72 h后趋于稳定。a*和L*是衡量肉类新鲜度最重要的颜色参数，真空包装处理组贮藏至144 h的L*和a*明显高于托盘包装和气调包装处理组，说明真空包装处理组羊肉的L*和a*最好，在贮藏至144 h仍能保持較好的色泽，本研究结果与董玉影[29]、Maqsood[30]等研究结果一致。随着贮藏时间的延长，不同包装方式处理组b*呈上升趋势，但是在不同包装之间无显著差异。
随着贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉剪切力呈先升高后降低的趋势。宰后后期24～144 h，高氧气调包装组剪切力显著高于托盘包装、低氧气调包装和真空包装组（P<0.05），说明真空包装处理组嫩度最好，原因可能是Hsp27表达量的下调增加了肌动蛋白的降解，肌肉中肌原纤维完整性衰减和内部Z线和I带连接处被破坏，从而导致肌原纤维超微结构发生变化，肉嫩度提高[31]。在冷藏后期72～144 h，真空包装处理组剪切力明显低于其他3 个处理组（P<0.05），在此期间Hsp70相对表达量也明显低于其他3 个处理组，推测真空包装处理组肉嫩度降低可能与Hsp70表达量有关。
持水能力是肉类加工的重要性能，羊肉蒸煮损失率是衡量肌肉持水能力的重要指标。随着贮藏时间的延长，除宰后1 h外不同包装方式羊肉蒸煮损失率总体呈先增加后降低的趋势，表明不同包装方式羊肉的持水能力随着时间的延长而降低;宰后6 h和12 h，真空包装处理组蒸煮损失率低于托盘包装、高氧气调包装和低氧气调包装，说明真空包装处理组羊肉持水能力较好。但是蒸煮损失率在不同包装之间差异不显著，证实了不同包装对蒸煮损失率没有显著影响，本研究结果与朱学伸等[32]研究一致。在宰后6 h，真空包装处理组蒸煮损失率明显低于托盘包装和气调包装处理组（P<0.05），此时真空包装处理组Hsp27、Hsp70相对表达量显著高于其他3 个处理组，原因可能是Hsp27、Hsp70表达量上调抑制了肌肉细胞凋亡，减少膜破裂和细胞内水分流失，使肉的保水能力增强。
2.4 不同包装方式下羊肉Hsp27、Hsp70表达量与pH值、肉色、剪切力和蒸煮损失率相关性分析
图中左下方数字表示各指标之间的相关系数，右上方圆圈表示各指标间的相关强度，圆圈越大表示相关性越强，蓝色表示负相关，红色表示正相关;*.相关性显著（P<0.05），**.相关性极显著（P<0.01）。
对不同包装方式羊肉冷藏1～144 h Hsp27和Hsp70相对表达量及品质进行相关性分析，可进一步明确这2 种潜在标志物与各品质的相关程度。由图5可知：Hsp27相对表达量与pH值呈显著正相关（P<0.05），相关系数为0.477，与剪切力呈正相关，与L*、b*和蒸煮损失率呈极显著负相关（P<0.01），相关系数分别为-0.632、-0.677和-0.723，与a*呈显著负相关（P<0.05），相关系数为-0.486;Hsp70相对表达量与pH值呈极显著负相关（P<0.01），相关系数为-0.565，与剪切力呈负相关，与L*、a*、b*呈极显著正相关（P<0.01），相关系数分别为0.608、0.592和0.804;与蒸煮损失率呈显著正相关（P<0.05），相关系数为0.436。
本研究中Hsp27相对表达量与pH值呈显著正相关与其他研究基本一致[24，33]，与肉色（L*、b*）呈极显著负相关，与a*呈显著负相关与Kim[11]、张淼[34]等的研究结果一致。蛋白质组学的研究结果中关于Hsp27与嫩度的关系并不一致，其中Ding Zhenjiang等[35]研究发现，Hsp27表达量与牛肉的韧性呈负相关，Huang Honggang等[19]研究发现，猪肉中Hsp27表达量与韧性呈正相关，本研究结果与Huang Honggang等[19]的研究结果一致。本研究中Hsp70相对表达量与pH值呈极显著负相关，与L*、a*、b*呈极显著正相关，这与Gagaoua等[7]研究结果一致。Hsp70相对表达量与剪切力呈负相关，Guillemin等[27]研究表明，Hsp70相对表达量与牛肉嫩度呈负相关，这与本研究结果一致。
3 结 论
随着贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉的pH值逐渐降低;在贮藏后期（144 h），真空包装处理组的L*和a*明显高于托盘包装和气调包装，剪切力显著低于托盘包装和气调包装。随着贮藏时间的延长，不同包装方式羊肉贮藏过程中Hsp27相对表达量呈先增加后降低趋势，Hsp70相对表达量呈逐渐上升趋势。Hsp27和Hsp70与羊肉品质的相关关系如下：Hsp27相对表达量与pH值、剪切力呈正相关，与L*、a*、b*和蒸煮损失率呈负相关;Hsp70相对表达量与pH值、剪切力呈负相关，与L*、a*、b*和蒸煮损失率呈正相关。本研究表明，Hsp27相对表达量上调、Hsp70相对表达量下调可提高羊肉的色泽和嫩度，且真空包装处理组羊肉保鲜效果最好。 参考文献：
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