【摘 要】
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目的利用生物信息学技术分析西妥昔单克隆抗体(以下简称单抗)耐药结直肠癌细胞中环状RNAcirc_0008274的表达水平，探索其参与西妥昔单抗耐药发生的机制。方法采用人结直肠癌细胞DiFi和Caco-2，设立10、50、100、150、200nmol/L5个西妥昔单抗浓度点，通过浓度递增法筛选并建立西妥昔单抗耐药结直肠癌细胞DiFi-R、Caco-2-R，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DiFi-R、Caco-2-R细胞与DiFi、Caco-2细胞中circ_0008274的表达水平。运用双萤光
【机 构】
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武汉大学人民医院消化内科，武汉 430061武汉大学人民医院消化内科，武汉 430061武汉大学人民医院消化内科，武汉 430061武汉大学人民医院消化内科，武汉 430061
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目的利用生物信息学技术分析西妥昔单克隆抗体(以下简称单抗)耐药结直肠癌细胞中环状RNA circ_0008274的表达水平，探索其参与西妥昔单抗耐药发生的机制。
方法采用人结直肠癌细胞DiFi和Caco-2，设立10、50、100、150、200 nmol/L 5个西妥昔单抗浓度点，通过浓度递增法筛选并建立西妥昔单抗耐药结直肠癌细胞DiFi-R、Caco-2-R，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DiFi-R、Caco-2-R细胞与DiFi、Caco-2细胞中circ_0008274的表达水平。运用双萤光素酶报告基因分析circ_0008274与miR-140-3p的偶联调控关系。采用免疫印迹法验证与西妥昔单抗耐药相关的高表达基因SMARCC1的蛋白质表达水平。采用si-circ_0008274转染方法敲除DiFi-R、Caco-2-R细胞中的circ_0008274，比较敲除前后的DiFi-R、Caco-2-R细胞的增殖活性和克隆形成数。将miR-140-3p模拟物和空白对照微RNA分别转染至DiFi-R、Caco-2-R细胞，比较转染miR-140-3p模拟物与转染空白对照微RNA的DiFi-R、Caco-2-R细胞增殖活性。分析敲除circ_0008274后的Caco-2-R细胞在pcDNA3.1 SMARCC1营救前后SMARCC1蛋白质水平和细胞增殖活性。纳入2019年3月至2020年8月于武汉大学人民医院住院接受西妥昔单抗治疗的15例结直肠癌患者的肿瘤标本，根据患者的治疗效果分为敏感组(11例)和耐药组(4例)；通过RT-PCR分析两组患者结直肠癌组织中circ_0008274、下游SMARCC1和miR-140-3p的相对表达水平。统计学方法采用独立样本t检验。
结果circ_0008274在DiFi-R细胞中的表达水平为DiFi细胞的(2.33±0.12)倍，在Caco-2-R细胞中的表达水平为Caco-2细胞的(2.92±0.42)倍，差异均有统计学意义(t＝19.97、7.80，均P
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