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目的
观察靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的嵌合抗原受体修饰T细胞(EGFRvⅢ/2CAR-T)对肝癌细胞SMMC-7721的特异杀伤作用。
方法二代EGFRvⅢ CAR表达框(EGFRvⅢ/2CAR，1 374 bp)克隆入PiggyBac转座子载体PB513B-1的XbaⅠ和BamHⅠ位点，转座子载体(PB-EGFRvⅢ/2CAR)和转座酶双质粒电穿孔(1×20 ms，840 V)转导人外周血T细胞，流式细胞术检测EGFRvⅢ/2CAR表达。Western blot法检测SMMC-7721中EGFRvⅢ表达。EGFRvⅢ/2CAR-T细胞和SMMC-7721细胞共培养，乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测特异杀伤作用、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测干扰素(IFN)-γ分泌水平。
结果重组载体PB-EGFRvⅢ/2CAR经XbaⅠ和BamHⅠ酶切、电泳分析及DNA测序证明基因片段连接无误、核酸序列正确。流式细胞术检测结果转座子/转座酶双质粒电穿孔外周血T细胞EGFRvⅢ/2CAR表达率为55.5%。Western blot显示SMMC-7721在相对分子质量145 000处EGFRvⅢ表达。EGFRvⅢ/2CAR-T和SMMC-7721共培养24 h，LDH释放试验证明肿瘤特异性杀伤，与效靶比呈正比(E∶T为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1)；ELISA检测到IFN-γ分泌量为(1 060.1±89.0) pg/ml，明显高于对照组(P＝0.000)。
结论靶向EGFRvⅢ的二代CAR-T细胞能够特异杀伤EGFRvⅢ＋的肝癌细胞SMMC-7721。