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目的为了开发和验证一种ELISA方法用于准确定量食蟹猴血清中抗KLH的IgG1和IgM抗体浓度,帮助评估食蟹猴TDAR实验中实验动物体内T细胞依赖性抗体的变化。方法本实验中ELISA检测方法基于商品化的猴血清KLHIgG1和IgM抗体检测试剂盒进行开发和优化。不同于常规的半定量的滴度判定法,本方法使用抗体标准品制定标准曲线对样本中的抗体浓度进行定量。根据法规相关要求对试剂盒的标准曲线范围进行了扩展,设定了相应的质量控制样本,之后按照法规要求对分析方法进行了全面的验证,验证参数包括准确性、精密度、稀释线性、平行性、钩镰效应、选择性和稳定性。结果以食蟹猴血清作为检测基质,对于抗KLH IgG1抗体的检测,样本的最低稀释倍数为1∶500,检测范围为1.0～50.0 ng.ml-1;而抗KLH IgM抗体检测的样本最低稀释倍数为1∶2000,检测范围为10～400 ng.ml-1。经过验证:检测方法批内和批间的准确性和精密度均满足接受标准(质控样本反算浓度的变异系数≤20%,偏差在±20%以内;最高或最低定量限接受标准为25%)。检测方法的稀释线性满足验证的接受标准,样本在进行进一步稀释时方法仍然能够准确检测原有浓度。抗KLH IgG1检测方法在检测加标浓度高达128 ng.ml-1的样本时未出现钩镰效应,相对应的抗KLH IgM检测方法在检测加标浓度高达1000 ng.ml-1的样本时未出现钩镰效应。通过在10个不同批次的基质中加标标准物质进行测试,证明了检测方法在基质中的回收率满足接受标准,基质效应干扰可接受。此外,样本存放于室温2 h、2～8℃一天和反复冻融6次的稳定性均得到验证。长期稳定性验证结果证明保存在≤-60℃条件下,猴血清样本中的KLH IgG1抗体能保持稳定至少4个月,KLHIgM抗体能保持稳定至少5个月。结论使用该分析方法可以在食蟹猴血清中准确定量抗KLH IgG1和IgM的抗体浓度,可应用于后续的食蟹猴TDAR实验,帮助准确评估TDAR实验不同时间段实验动物体内T细胞依赖性抗体变化的情况。