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摘 要：目的 建立一组新型偶联剂测定腌菜中亚硝酸盐含量的方法。方法 在酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸起重氮化反应，重氮化合物在PH7.5的磷酸盐缓冲液中与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮偶合成金黄色染料。在此方法基础上，利用紫外分光光度法测定腌菜中亚硝酸盐的含量。结果 亚硝酸盐含量在0.2-6.3mg/L范围内，符合朗伯-比耳定律，该络合物在390nm处具有最大吸光度，相关系数r=0.99998，其精密度（RSD）<1%，回收率96.4 %-98.6%。被测腌菜每克中亚硝酸盐的含量为86.7μg。结论 得到了一种新的测定亚硝酸盐含量的试剂方法，该方法测定亚硝酸盐含量精密度高，准确度好，对腌菜中亚硝酸盐含量的测定具有很强的应用价值。
关键词：分光光度法；重氮化反应；亚硝酸盐；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A
亚硝酸盐为一种含氮的无机化合物，主要应用于食物防腐、化肥和染料等领域，广泛存在于环境及食物中。在日常生活中，亚硝酸盐是一种严重的污染物[1]；大量的亚硝酸盐也会引起相应的健康问题：长期食用含有高浓度亚硝酸盐的食物不仅会引起高铁血红蛋白血症[2]，甚至还会致癌[3]。
本实验报道了一组新型偶联试剂，利用分光光度法测定亚硝酸盐的含量，即1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮作为偶氮试剂应用于实验中。实验中亚硝酸盐与对氨基苯磺酸在酸性介质中反应生成重氮化合物，此化合物再在PH7.5磷酸盐缓冲液中与相对无毒的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮反应产生金黄色偶氮产物。该方法选择性高、稳定性好，能为腌菜样本中亚硝酸盐含量的测定提供精确的参数。
1材料与方法
1.1仪器
UV2501-PC型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司），BT125D型电子分析天平（德国赛托利斯公司），XB868型精密PH计（中国柯迪达公司），DHG-9140A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂）。
1.2试剂
所用试剂均为分析纯，所用水均为超纯水。
1.2.1亚硝酸钠标准溶液（1.000g/L）：准确称取110℃干燥4h的亚硝酸钠0.100g，加水溶解于100mL容量瓶内，并定容至刻度线。使用前稀释成相应的标准工作溶液。
1.2.2对氨基苯磺酸溶液（8.0g/L）：准确称取对氨基苯磺酸0.8g，用PH0.5的盐酸溶解，并定容至100mL。
1.2.3 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液（1.0g/L）：准确称取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮0.1g，少量水溶解并定容至100mL。
1.2.4 PH7.5磷酸盐缓冲溶液（0.2M）：准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）7.16g，少量水溶解并定容至100mL，准确称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.624g，少量水溶解并定容至20mL，将84mL磷酸氢二钠溶液及16mL磷酸二氢钠溶液混合均匀。
1.2.5饱和硼砂溶液 （50g/L） ：准确称取硼砂（Na2B4O7·10H2O）5.0 g，溶解于100ml热水中。
1.2.6乙酸锌溶液 （220g/L） ：准确称取乙酸锌[Zn（CH3COO）·2H2O]220.0 g，30ml醋酸溶解并用水定容至1000ml。
1.2.7.亚铁氰化钾溶液 （106g/L）：准确称取亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]106.0g，用水溶解并定容至1000ml。
1.3 实验方法
1.3.1吸收谱图
准确吸取1mL 0、6、9、12、15、18mg/L亚硝酸钠标准使用液，分别置于10mL比色管中，加入对氨基苯磺酸溶液（8.0g/L）1mL，混匀后再加入PH7.5磷酸盐缓冲溶液（0.2M）1mL及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液（1.0g/L）1mL，加水至刻度线，混匀静置20min。以超纯水为空白对照，在波长390 nm处测定吸光度。
1.3.2测定腌菜中亚硝酸盐的含量
将腌菜用搅拌机搅拌成均质匀浆。将5g腌菜匀浆放入500ml容量瓶中，加入12.5mL饱和硼砂溶液，之后用70℃的水定容至300mL，摇匀，放入开水浴中5min后拿出冷却至室温。将冷却的提取液再加入5ml乙酸锌溶液，摇匀，再5mL亚铁氰化钾溶液，混合均匀，加水至刻度，混匀后室温放置30min，滤纸过滤后待测。分别吸取1mL过滤后的腌菜标本净化液于4个10mL比色管中，再分别再加入浓度为0、0.5、0.75、1mg/L亚硝酸盐标准工作液，参照吸收谱图方法测定亚硝酸盐含量。按照测得量和添加量之比计算回收率。
2结果
2.1实验结果
本实验中亚硝酸盐首先与对氨基苯磺酸溶液反应生成重氮化合物，重氮化合物后在PH7.5磷酸盐缓冲液中与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液反应生成金黄色染料，测得其最大吸光波长为390 nm （表1）。
表1 测定亚硝酸盐含量的相关参数
附：方法的标准曲线
2.2精密度的研究
根据线性范围选定六个浓度由低到高的亚硝酸盐标准工作液，按照上述方法，每天测定六次，每次间隔1h，记录各测定值，计算日内精密度；每天同一时间，测定六天，记录各测定值，计算日间精密度。结果显示，日内精密度RSD值为0.1-0.7%，日间精密度RSD值为0.1-0.9% （表2）。
表2 日内精密度及日间精密度（n=6）
2.3回收率与应用
本实验方法已预应用于测定腌菜中亚硝酸盐的含量，其测量结果与亚硝酸盐-磺胺-N-（1-萘基）二乙胺法[4]测量结果比较。结果显示，本法测定腌菜中亚硝酸盐含量的平均回收率为97.8%，准确度较高（表3）。而亚硝酸盐-磺胺-N-（1-萘基）二乙胺法测定相同的腌菜样本未检测出亚硝酸盐。 表3 本实验方法测定腌菜样本中亚硝酸盐含量的回收率 ？x ±SD （n = 5）
测量腌菜为5g，测得处理后1mL液体中亚硝酸盐含量为（0.867±0.044）mg/L，则可推算出此腌菜每克中亚硝酸盐的含量为86.7μg。
3 讨论
本实验为在室温条件下完成。用PH计准确测定PH 分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、1、1.5、2的盐酸备用液。选取10个洁净的10mL比色管，分别编号1-10。按实验方法，加入不同PH值的盐酸溶液完成反应，测定吸光度值，实验结果表明，当盐酸溶液PH4.5时，反应产物最稳定。
对氨基苯磺酸用量的确定：准确配制浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10g/L对氨基苯磺酰胺备用液。选取16个洁净的10mL比色管，分别编号1-16。按实验方法，加入不同浓度的对氨基苯磺酸溶液完成反应，测定吸光度值，实验结果表明，吸光度随对氨基苯磺酸溶液浓度增加而增大，当对氨基苯磺酸溶液浓度为4g/L时，吸光度稳定不变。本实验选择对氨基苯磺酸溶液浓度为8g/L。
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮用量的确定：准确配制浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3g/L盐酸萘乙二胺备用液。选取8个洁净的10mL比色管，分别编号1-8。按实验方法，加入不同浓度的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液完成反应，测定吸光度值，实验结果表明，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液浓度选择为1g/L产物最稳定。
亚硝酸盐与对氨基苯磺酸溶液反应生成的重氮产物在碱性介质中可与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮反应生成最终的金黄色偶联染料。在对不同碱性介质的研究中发现，0.2M PH7.5的磷酸盐缓冲溶液比氨水溶液、氢氧化钠溶液及氢氧化钠与弱碱混合生成的缓冲液得到的偶联产物更稳定。
本实验提供了一组新型的偶氮试剂，利用对氨基苯磺酸-亚硝酸盐-（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）偶联-分光光度法检测定腌菜中亚硝酸盐的含量。其中所用试剂对氨基苯磺酸及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮相对无毒，在实际工作中与其他试剂相比更安全，减少二次污染[5，6，7]。该方法准确度和精密度高[8，9]，且最终产物稳定性较好 ，是测定腌菜等亚硝酸盐含量相对较好的方法。
参考文献
[1] Thomson BM，？Nokes CJ，？Cressey PJ. Intake and risk assessment of nitrate and nitrite from New Zealand foods and drinking water [J] Food Addit Contam， 2007，24（2）： 113-219.
[2] Savino F， Maccario S， Migliore G， Oggero R， Silvestro L. Blue baby syndrome [J] J Pediatr Gastroenterol Nutr， 2002，34（5）： 563- 573.
[3] De Roos AJ， Ward MH， Lynch CF， Cantor KP. Nitrate in public water supplies and the risk of colon and rectum cancers [J] Epidemiology， 2003，14（6）： 60-64.
[4] William Horwitz. Official Methods of Analysis of AOAC International，17th Edition， Gaithersburg，Md.， 2000： 39.1.21.
[5] P. Nagaraj， J. S. Prakash， A. Shivakumar， A. K. Shrestha. Sensitive spectrophotometric methods for the assessment of nitrite in water sample [J] Environ. Monit.Assess， 2008，147（1-3）： 235-241.
[6] Hayati Filik， Derya Giray， Burak Ceylan， Res. A novel fiber optic spectrophotometric determination of nitrite using Safranin O and cloud point extraction [J] Talanta， 2011，85： 1818-1824.
[7] S. Flamerz， W.A. Bashir. Photometric determination of nitrite [J] Microchem. J.， 1981，26（4）： 586–589.
[8] Reddy， M. C. S. New reagent for determination of trace levels of nitrite in environmental samples [J] J. Sci. Indust. Res.， 2004，63（2）： 172-176.
[9] M. Pandurangappa and Y. Venkataramanappa， Aminophenyl benzimidazole as a new reagent for the estimation of NO2-/nitrite/nitrate at trace level： application to environmental samples [J] Anal. Lett.， 2007，40（15）： 2974-2991.
？本课题为昆明医科大学研究生创新基金（No. 1141501527）资助项目之一
第一作者：张鑫，（1987-），女，辽宁省大连市，在读硕士研究生，法医毒物分析方向。
通讯作者：刘清，E-mail：zhangchenand@126.com
关键词：分光光度法；重氮化反应；亚硝酸盐；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A
亚硝酸盐为一种含氮的无机化合物，主要应用于食物防腐、化肥和染料等领域，广泛存在于环境及食物中。在日常生活中，亚硝酸盐是一种严重的污染物[1]；大量的亚硝酸盐也会引起相应的健康问题：长期食用含有高浓度亚硝酸盐的食物不仅会引起高铁血红蛋白血症[2]，甚至还会致癌[3]。
本实验报道了一组新型偶联试剂，利用分光光度法测定亚硝酸盐的含量，即1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮作为偶氮试剂应用于实验中。实验中亚硝酸盐与对氨基苯磺酸在酸性介质中反应生成重氮化合物，此化合物再在PH7.5磷酸盐缓冲液中与相对无毒的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮反应产生金黄色偶氮产物。该方法选择性高、稳定性好，能为腌菜样本中亚硝酸盐含量的测定提供精确的参数。
1材料与方法
1.1仪器
UV2501-PC型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司），BT125D型电子分析天平（德国赛托利斯公司），XB868型精密PH计（中国柯迪达公司），DHG-9140A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂）。
1.2试剂
所用试剂均为分析纯，所用水均为超纯水。
1.2.1亚硝酸钠标准溶液（1.000g/L）：准确称取110℃干燥4h的亚硝酸钠0.100g，加水溶解于100mL容量瓶内，并定容至刻度线。使用前稀释成相应的标准工作溶液。
1.2.2对氨基苯磺酸溶液（8.0g/L）：准确称取对氨基苯磺酸0.8g，用PH0.5的盐酸溶解，并定容至100mL。
1.2.3 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液（1.0g/L）：准确称取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮0.1g，少量水溶解并定容至100mL。
1.2.4 PH7.5磷酸盐缓冲溶液（0.2M）：准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）7.16g，少量水溶解并定容至100mL，准确称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.624g，少量水溶解并定容至20mL，将84mL磷酸氢二钠溶液及16mL磷酸二氢钠溶液混合均匀。
1.2.5饱和硼砂溶液 （50g/L） ：准确称取硼砂（Na2B4O7·10H2O）5.0 g，溶解于100ml热水中。
1.2.6乙酸锌溶液 （220g/L） ：准确称取乙酸锌[Zn（CH3COO）·2H2O]220.0 g，30ml醋酸溶解并用水定容至1000ml。
1.2.7.亚铁氰化钾溶液 （106g/L）：准确称取亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]106.0g，用水溶解并定容至1000ml。
1.3 实验方法
1.3.1吸收谱图
准确吸取1mL 0、6、9、12、15、18mg/L亚硝酸钠标准使用液，分别置于10mL比色管中，加入对氨基苯磺酸溶液（8.0g/L）1mL，混匀后再加入PH7.5磷酸盐缓冲溶液（0.2M）1mL及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液（1.0g/L）1mL，加水至刻度线，混匀静置20min。以超纯水为空白对照，在波长390 nm处测定吸光度。
1.3.2测定腌菜中亚硝酸盐的含量
将腌菜用搅拌机搅拌成均质匀浆。将5g腌菜匀浆放入500ml容量瓶中，加入12.5mL饱和硼砂溶液，之后用70℃的水定容至300mL，摇匀，放入开水浴中5min后拿出冷却至室温。将冷却的提取液再加入5ml乙酸锌溶液，摇匀，再5mL亚铁氰化钾溶液，混合均匀，加水至刻度，混匀后室温放置30min，滤纸过滤后待测。分别吸取1mL过滤后的腌菜标本净化液于4个10mL比色管中，再分别再加入浓度为0、0.5、0.75、1mg/L亚硝酸盐标准工作液，参照吸收谱图方法测定亚硝酸盐含量。按照测得量和添加量之比计算回收率。
2结果
2.1实验结果
本实验中亚硝酸盐首先与对氨基苯磺酸溶液反应生成重氮化合物，重氮化合物后在PH7.5磷酸盐缓冲液中与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液反应生成金黄色染料，测得其最大吸光波长为390 nm （表1）。
表1 测定亚硝酸盐含量的相关参数
附：方法的标准曲线
2.2精密度的研究
根据线性范围选定六个浓度由低到高的亚硝酸盐标准工作液，按照上述方法，每天测定六次，每次间隔1h，记录各测定值，计算日内精密度；每天同一时间，测定六天，记录各测定值，计算日间精密度。结果显示，日内精密度RSD值为0.1-0.7%，日间精密度RSD值为0.1-0.9% （表2）。
表2 日内精密度及日间精密度（n=6）
2.3回收率与应用
本实验方法已预应用于测定腌菜中亚硝酸盐的含量，其测量结果与亚硝酸盐-磺胺-N-（1-萘基）二乙胺法[4]测量结果比较。结果显示，本法测定腌菜中亚硝酸盐含量的平均回收率为97.8%，准确度较高（表3）。而亚硝酸盐-磺胺-N-（1-萘基）二乙胺法测定相同的腌菜样本未检测出亚硝酸盐。 表3 本实验方法测定腌菜样本中亚硝酸盐含量的回收率 ？x ±SD （n = 5）
测量腌菜为5g，测得处理后1mL液体中亚硝酸盐含量为（0.867±0.044）mg/L，则可推算出此腌菜每克中亚硝酸盐的含量为86.7μg。
3 讨论
本实验为在室温条件下完成。用PH计准确测定PH 分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、1、1.5、2的盐酸备用液。选取10个洁净的10mL比色管，分别编号1-10。按实验方法，加入不同PH值的盐酸溶液完成反应，测定吸光度值，实验结果表明，当盐酸溶液PH4.5时，反应产物最稳定。
对氨基苯磺酸用量的确定：准确配制浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10g/L对氨基苯磺酰胺备用液。选取16个洁净的10mL比色管，分别编号1-16。按实验方法，加入不同浓度的对氨基苯磺酸溶液完成反应，测定吸光度值，实验结果表明，吸光度随对氨基苯磺酸溶液浓度增加而增大，当对氨基苯磺酸溶液浓度为4g/L时，吸光度稳定不变。本实验选择对氨基苯磺酸溶液浓度为8g/L。
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮用量的确定：准确配制浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3g/L盐酸萘乙二胺备用液。选取8个洁净的10mL比色管，分别编号1-8。按实验方法，加入不同浓度的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液完成反应，测定吸光度值，实验结果表明，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液浓度选择为1g/L产物最稳定。
亚硝酸盐与对氨基苯磺酸溶液反应生成的重氮产物在碱性介质中可与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮反应生成最终的金黄色偶联染料。在对不同碱性介质的研究中发现，0.2M PH7.5的磷酸盐缓冲溶液比氨水溶液、氢氧化钠溶液及氢氧化钠与弱碱混合生成的缓冲液得到的偶联产物更稳定。
本实验提供了一组新型的偶氮试剂，利用对氨基苯磺酸-亚硝酸盐-（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）偶联-分光光度法检测定腌菜中亚硝酸盐的含量。其中所用试剂对氨基苯磺酸及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮相对无毒，在实际工作中与其他试剂相比更安全，减少二次污染[5，6，7]。该方法准确度和精密度高[8，9]，且最终产物稳定性较好 ，是测定腌菜等亚硝酸盐含量相对较好的方法。
参考文献
[1] Thomson BM，？Nokes CJ，？Cressey PJ. Intake and risk assessment of nitrate and nitrite from New Zealand foods and drinking water [J] Food Addit Contam， 2007，24（2）： 113-219.
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[3] De Roos AJ， Ward MH， Lynch CF， Cantor KP. Nitrate in public water supplies and the risk of colon and rectum cancers [J] Epidemiology， 2003，14（6）： 60-64.
[4] William Horwitz. Official Methods of Analysis of AOAC International，17th Edition， Gaithersburg，Md.， 2000： 39.1.21.
[5] P. Nagaraj， J. S. Prakash， A. Shivakumar， A. K. Shrestha. Sensitive spectrophotometric methods for the assessment of nitrite in water sample [J] Environ. Monit.Assess， 2008，147（1-3）： 235-241.
[6] Hayati Filik， Derya Giray， Burak Ceylan， Res. A novel fiber optic spectrophotometric determination of nitrite using Safranin O and cloud point extraction [J] Talanta， 2011，85： 1818-1824.
[7] S. Flamerz， W.A. Bashir. Photometric determination of nitrite [J] Microchem. J.， 1981，26（4）： 586–589.
[8] Reddy， M. C. S. New reagent for determination of trace levels of nitrite in environmental samples [J] J. Sci. Indust. Res.， 2004，63（2）： 172-176.
[9] M. Pandurangappa and Y. Venkataramanappa， Aminophenyl benzimidazole as a new reagent for the estimation of NO2-/nitrite/nitrate at trace level： application to environmental samples [J] Anal. Lett.， 2007，40（15）： 2974-2991.
？本课题为昆明医科大学研究生创新基金（No. 1141501527）资助项目之一
第一作者：张鑫，（1987-），女，辽宁省大连市，在读硕士研究生，法医毒物分析方向。
通讯作者：刘清，E-mail：zhangchenand@126.com