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摘要 [目的]以烟草β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列为材料,对其特性进行深度挖掘。[方法]采用NCBI-PROTEIN筛选蛋白序列,依次运用ProtParam、SignalP 4.1和TMHMM 2.0工具进行预测并分析烟草葡聚糖酶的理化特性、信号肽和跨膜结构的组成成分。[结果]NtBGl-2的分子量最大(40 390.76 Dk),NtBGl-3的分子量最小(37 722.64 Dk);NtBGl-1和NtBGl-2的等电点小于7.0,而NtBGl-3的等电点大于7.0;NtBGl-1和NtBGl-2属于不稳定蛋白,NtBGl-3属于稳定性蛋白,且耐热性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的优势氨基酸为甘氨酸和丝氨酸,NtBGl-3的为天冬酰氨和丙氨酸;NtBGl均含有信号肽,属于分泌蛋白;NtBGl-1无跨膜区,而NtBGl-2(13 ~35)和NtBGl-3(7 ~29)含有跨膜结构区域,属于跨膜蛋白。[结论]该研究为深入研究烟草葡聚糖酶奠定基础。
关键词 烟草;β-1,3-葡聚糖酶;生物学
中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2018)17-0096-02
Abstract [Objective] The amino acid sequence of tobacco β1,3glucanase was used as a material to deeply explore its characteristics. [Method]NCBIPROTEIN was used to screen protein sequences, and ProtParam, SignalP 4.1 and TMHMM 2.0 tools were used to predict physicochemical properties, signal peptide and transmembrane structure of tobacco glucan enzyme. [Result]The molecular weight of NtBGl2 was the maximum (40 390.76 Dk), and that of NtBGl3 was the minimum (37 722.64 Dk); the isoelectric point of NtBGl1 and NtBGl2 was less than 7.0, but NtBGl3 was more than 7.0; NtBGl1 and NtBGl2 were unstable proteins, NtBGl3 was a stable protein, and the heat resistance was greater than that of NtBGl1 and NtBGl2; the dominant amino acids of NtBGl1 and NtBGl2 were glycine and serine, NtBGl3 for asparagine and alanine; NtBGl contained signal peptide, belonged to secreted proteins; NtBGl1 had no transmembrane domain, while NtBGl2 (13 ~35) and NtBGl3 (7 ~29) contained transmembrane structure, and belonged to transmembrane proteins.[Conclusion]This study lays the foundation for indepth study of tobacco glucanase.
Key words Tobacco; β 1,3 Glucan; Biology
β-1,3-葡聚糖酶具有水解β型的1,3糖苷键的葡聚糖聚合体的作用[1-2],由于葡聚糖是植物细胞壁的重要组成部分,因此葡聚糖酶具有促进植物体软化的作用[3]。此外,葡聚糖酶具有抵抗部分细菌和真菌的入侵[4-6]。正常情况下,葡聚糖酶较少在植物体内积累,且活性较低,当受到病原微生物入侵时,葡聚糖酶的表达量增加,在体内大量合成,同时产生部分同工酶,进而发挥抵抗病原菌入侵的作用[7-9],如水稻被稻瘟菌感染,诱导葡聚糖酶的活性增加3~5倍[10];烟草的坏疽病感染黄瓜叶,促使葡聚糖酶的活性增加6倍[11]。
目前,关于烟草葡聚糖酶的研究主要集中在其抵抗病原微生物,主要包括花叶病[12]、疫霉病[13]、立枯絲核菌[14]、坏疽病[11]等。为更深层次地认识烟草β-1,3-葡聚糖酶的生物学特性,笔者利用生物信息学的方法进行研究,进而为深入研究烟草葡聚糖酶奠定基础。
1 材料与方法
1.1 筛选烟草β-1,3-葡聚糖酶家族成员
采用NCBI-PROTEIN[15]数据库在线检索,筛选烟草葡聚糖酶相关的蛋白序列,获取的登录号分别是AAA63541.1、ACF93731.1和AAA63542.1,依据优势氨基酸和氨基酸数进行命名,分别为NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3[16]。
1.2 方法 以ProtParam的工具[17]测定序列的理化特性,如烟草葡聚糖酶的氨基酸数、分子量、理论等电点、不稳定指数、脂肪族指数和优势氨基酸;使用SignalP 4.1的在线服务[18],其D-cutoff值以Matthews的相关系数进行测定;采用TMHMM 2.0工具[19],根据疏水性氨基酸,对烟草葡聚糖酶的跨膜结构进行分析。
2 结果与分析
2.1 烟草β-1,3-葡聚糖酶理化特性的分析 通过在线工具(PROTPARAM)预测NtBGl的相关理化特性,结果显示(表1),NtBGl-2的氨基酸数最多(370),其次是NtBGl-1,为359个,NtBGl-3的最小,含有343个氨基酸;对于烟草葡聚糖酶,以NtBGl-2的分子量最大,其分子量为40 390.76 Da,而NtBGl-3的分子量最小(37 722.64 Da);通过测定烟草葡聚糖酶的等电点,NtBGl-1和NtBGl-3的等电点分别为6.60和5.12,均属于酸性蛋白,而NtBGl-2的等电点值最大(7.10),属于碱性蛋白;NtBGl-1和NtBGl-2的不稳定指数均大于40,其值分别为42.49和44.28,因此NtBGl-1和NtBGl-2属于不稳定性蛋白,而NtBGl-3的不稳定指数为37.47,即NtBGl-3属于稳定性蛋白;NtBGl-3的脂肪族指数最大(90.20),说明NtBGl-3的耐热性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的優势氨基酸相同,均为甘氨酸(含量分别为9.2%、8.9%)和丝氨酸(含量分别为9.2%、9.5%),NtBGl-3的优势氨基酸为天冬酰氨(9.6%)和丙氨酸(10.2%)。
2.2 烟草β-1,3-葡聚糖酶的信号肽分析
从信号肽、原始的剪切位点和综合的剪切位点3个方面分析烟草葡聚糖酶的信号肽发现(图1),NtBGl-1第10位亮氨酸的信号肽值(S)达到最大(0.970),而原始的剪切位点(C)和综合的剪切位点(Y)的最大分值均处于第22位谷氨酰胺,其值分别为0.810和0.856,因此NtBGl-1具有信号肽,剪切位点处于第21与22位氨基酸之间,信号肽处于第1~21位的氨基酸,该信号肽的均值为0.902;NtBGl-2的信号肽值于第20位亮氨酸处达到最大(0.957),原始的剪切位点和综合的剪切位点的最大分值均处于第33位谷氨酰胺,其值分别为0.742和0.795,即NtBGl-2具有信号肽,剪切位点处于第32~33位氨基酸,信号肽处于第1~32位的氨基酸,该信号肽的均值为0.846;NtBGl-3的信号肽值于第9位苯丙氨酸处达到最大(0.986),原始的剪切位点和综合的剪切位点的最大分值均处于第30位谷氨酰胺,其值分别为0.615和0.753,表明NtBGl-3具有信号肽,剪切位点处于第29与30位氨基酸之间, 且信号肽处于第1~29位的氨基酸,该信号肽的均值为0.929。综上所述,烟草葡聚糖酶均具有信号肽,即属于分泌蛋白。
2.3 烟草β-1,3-葡聚糖酶的跨膜结构分析
蛋白酶可通过跨膜结构锚定于质膜上,进而在亚细胞结构的特定区域参与信号传递或代谢活动,因此对NtBGl的跨膜结构进行分析,结果显示(图2),NtBGl-1序列位于膜内的氨基酸数为3.50,小于20.00,即NtBGl-1不具有跨膜结构;NtBGl-2和NtBGl-3位于膜内序列的氨基酸数分别为20.97和22.74,均大于20.00,表明NtBGl-2和NtBGl-3含有跨膜结构,其概率分别为0.947和0.993;NtBGl-2的第1~12位氨基酸位于
膜内,第13 ~35位氨基酸为跨膜区,第36~370位的氨基酸处于膜外;NtBGl-3的第1~6位氨基酸位于膜内,第7~29位氨基酸为跨膜区,第30~343位的氨基酸处于膜外。综上所述,除NtBGl-1外,NtBGl含有跨膜结构。
3 结论与讨论
通过理化特性分析,NtBGl-2等电点大于7.0,因此,NtBGl-2可能定位于液泡,且具有降解病原菌菌丝的功能[20],但NtBGl-2属于不稳定性蛋白,因此NtBGl-2可能诱导同工酶、几丁质、核糖体等共同作用,进行抵抗病原微生物[7-8];NtBGl均属于分泌蛋白,具有信号肽,从而指引烟草葡聚糖酶运输于特定区域,参与相应的抗性反应[21];NtBGl-2(第13 ~35位氨基酸)和NtBGl-3(7 ~29)均含有跨膜结构,因此,NtBGl-2和NtBGl-3可能参与信号的传递[22]。
参考文献
[1] 蒋选利,李振岐,康振生.β-1,3-葡聚糖酶与植物的抗病性[J].西北农业学报,2005, 14(4):135-139.
[2] DOXEY A C,YAISH M W F,MOFFATT B A,et al.Functional divergence in the Arabidopsis β1,3glucanase gene family inferred by phylogenetic reconstruction of expression states[J]. Molecular biology &evolution,2007,24(4):1045-1055.
[3] CHOURASIA A,SANE V A,SINGH R K,et al.Isolation and characterization of the MiCel1 gene from mango:Ripening related expression and enhanced endoglucanase activity during softening[J]. Plant growth regulation,2008,56(2):117-127.
[4] 欧阳波,李汉霞,叶志彪.植物β-1,3-葡聚糖酶及其基因[J].中国生物工程杂志,2002,22(6):18-23.
[5] 刘爱新,董汉松,梁元存,等.烟草几丁酶β-1,3-葡聚糖酶的抑菌作用[J].微生物学通报,1999,26(1):15-17.
[6] COLLINGE D B,SLUSARENKO A J.Plant gene expression in response to pathogens[J].Plant molecular biology,1987,9(4):389-410. [7] 左豫虎,康振生,杨传平,等.β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性与大豆对疫霉根腐病抗性的关系[J].植物病理学报,2009,39(6):600-607.
[8] LAWRENCE C B,JOOSTEN M H A J,TUZUN S.Differential induction of pathogenesis-related proteins in tomato by Alternaria solani and the association of a basic chitinase isozyme with resistance[J]. Physiological &molecular plant pathology,1996,48(6):361-377.
[9] LAWRENCE C B,SINGH N P,QIU J S,et al.Constitutive hydrolytic enzymes are associated with polygenic resistance of tomato to Alternaria solani and may function as an elicitor release mechanism[J]. Physiological &molecular pant pathology,2000,57(5):211-220.
[10] 杜良成,王钧.稻瘟菌诱导的水稻几丁酶、β-1.3-葡聚糖酶活性及分布[J].植物生理与分子生物学学报,1992,18(1):29-36.
[11] REPKA V,TAMS L,FISCHEROV I,et al.Identification and partial characterization of beta1,3glucanase from virusinfected cucumber cotyledons[J].Acta virologica,1997, 41(1):35-39.
[12] KANG M K,PARK K S,CHOI D.Coordinated expression of defenserelated genes by TMV infection or salicylic acid treatment in tobacco[J].Molecules &cells,1998,8(4):388-392.
[13] PAZ LAGO D,GUTIERREZ A,LUZARDO L.Biological relevance of the enzyme beta 1,3 glucanase on the activation of systemic resistance of tobacco induced by the fungal cell wall[J].Cultivos tropicales,1998,19(3):25-27.
[14] 遲彦.大豆β-1,3-葡聚糖酶基因转化烟草及抗病性的研究[J].大连大学学报,2001, 22(6):37-41.
[15] SAYERS E.NCBI protein resources:The NCBI handbook[M].Bethesda:National Center for Biotechnology Information,2013.
[16] 陈二龙,苏家恩,范志勇,等.Bright Yellow 2烤烟热激蛋白90生物信息学分析[J].南方农业学报,2017,48(10):1734-1740.
[17] SEZUTSU H,KAJIWARA H,KOJIMA K,et al.Identification of four major hornet silk genes with a complex of alaninerich and serinerich sequences in Vespa simillima xanthoptera Cameron[J].Bioscience biotechnology &biochemistry,2007,71(11):2725-2734.
[18] BENDTSEN J D,NIELSEN H,WIDDICK D,et al.Prediction of twin-arginine signal peptides[J].BMC Bioinformatics,2005,6(1):167.
[19] KROGH A,LARSSON B,VON HEIJNE G,et al.Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model:Application to complete genomes[J].Journal of molecular biology,2001,305(3):567-580.
[20] ANFOKA G,BUCHENAUER H.Systemic acquired resistance in tomato against Phytophthora infestans by preinoculation with tobacco necrosis virus[J].Physiological &molecular plant pathology,1997,50(2):85-101.
[21] 何江峰,韩冰,赵宏鑫.植物β-1,3-葡聚糖酶的研究进展[J].内蒙古农业科技,2006(5):21-25.
[22] 方静平,苏亚春,游倩,等.甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析[J].生物信息学, 2012,10(3):199-207.
关键词 烟草;β-1,3-葡聚糖酶;生物学
中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2018)17-0096-02
Abstract [Objective] The amino acid sequence of tobacco β1,3glucanase was used as a material to deeply explore its characteristics. [Method]NCBIPROTEIN was used to screen protein sequences, and ProtParam, SignalP 4.1 and TMHMM 2.0 tools were used to predict physicochemical properties, signal peptide and transmembrane structure of tobacco glucan enzyme. [Result]The molecular weight of NtBGl2 was the maximum (40 390.76 Dk), and that of NtBGl3 was the minimum (37 722.64 Dk); the isoelectric point of NtBGl1 and NtBGl2 was less than 7.0, but NtBGl3 was more than 7.0; NtBGl1 and NtBGl2 were unstable proteins, NtBGl3 was a stable protein, and the heat resistance was greater than that of NtBGl1 and NtBGl2; the dominant amino acids of NtBGl1 and NtBGl2 were glycine and serine, NtBGl3 for asparagine and alanine; NtBGl contained signal peptide, belonged to secreted proteins; NtBGl1 had no transmembrane domain, while NtBGl2 (13 ~35) and NtBGl3 (7 ~29) contained transmembrane structure, and belonged to transmembrane proteins.[Conclusion]This study lays the foundation for indepth study of tobacco glucanase.
Key words Tobacco; β 1,3 Glucan; Biology
β-1,3-葡聚糖酶具有水解β型的1,3糖苷键的葡聚糖聚合体的作用[1-2],由于葡聚糖是植物细胞壁的重要组成部分,因此葡聚糖酶具有促进植物体软化的作用[3]。此外,葡聚糖酶具有抵抗部分细菌和真菌的入侵[4-6]。正常情况下,葡聚糖酶较少在植物体内积累,且活性较低,当受到病原微生物入侵时,葡聚糖酶的表达量增加,在体内大量合成,同时产生部分同工酶,进而发挥抵抗病原菌入侵的作用[7-9],如水稻被稻瘟菌感染,诱导葡聚糖酶的活性增加3~5倍[10];烟草的坏疽病感染黄瓜叶,促使葡聚糖酶的活性增加6倍[11]。
目前,关于烟草葡聚糖酶的研究主要集中在其抵抗病原微生物,主要包括花叶病[12]、疫霉病[13]、立枯絲核菌[14]、坏疽病[11]等。为更深层次地认识烟草β-1,3-葡聚糖酶的生物学特性,笔者利用生物信息学的方法进行研究,进而为深入研究烟草葡聚糖酶奠定基础。
1 材料与方法
1.1 筛选烟草β-1,3-葡聚糖酶家族成员
采用NCBI-PROTEIN[15]数据库在线检索,筛选烟草葡聚糖酶相关的蛋白序列,获取的登录号分别是AAA63541.1、ACF93731.1和AAA63542.1,依据优势氨基酸和氨基酸数进行命名,分别为NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3[16]。
1.2 方法 以ProtParam的工具[17]测定序列的理化特性,如烟草葡聚糖酶的氨基酸数、分子量、理论等电点、不稳定指数、脂肪族指数和优势氨基酸;使用SignalP 4.1的在线服务[18],其D-cutoff值以Matthews的相关系数进行测定;采用TMHMM 2.0工具[19],根据疏水性氨基酸,对烟草葡聚糖酶的跨膜结构进行分析。
2 结果与分析
2.1 烟草β-1,3-葡聚糖酶理化特性的分析 通过在线工具(PROTPARAM)预测NtBGl的相关理化特性,结果显示(表1),NtBGl-2的氨基酸数最多(370),其次是NtBGl-1,为359个,NtBGl-3的最小,含有343个氨基酸;对于烟草葡聚糖酶,以NtBGl-2的分子量最大,其分子量为40 390.76 Da,而NtBGl-3的分子量最小(37 722.64 Da);通过测定烟草葡聚糖酶的等电点,NtBGl-1和NtBGl-3的等电点分别为6.60和5.12,均属于酸性蛋白,而NtBGl-2的等电点值最大(7.10),属于碱性蛋白;NtBGl-1和NtBGl-2的不稳定指数均大于40,其值分别为42.49和44.28,因此NtBGl-1和NtBGl-2属于不稳定性蛋白,而NtBGl-3的不稳定指数为37.47,即NtBGl-3属于稳定性蛋白;NtBGl-3的脂肪族指数最大(90.20),说明NtBGl-3的耐热性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的優势氨基酸相同,均为甘氨酸(含量分别为9.2%、8.9%)和丝氨酸(含量分别为9.2%、9.5%),NtBGl-3的优势氨基酸为天冬酰氨(9.6%)和丙氨酸(10.2%)。
2.2 烟草β-1,3-葡聚糖酶的信号肽分析
从信号肽、原始的剪切位点和综合的剪切位点3个方面分析烟草葡聚糖酶的信号肽发现(图1),NtBGl-1第10位亮氨酸的信号肽值(S)达到最大(0.970),而原始的剪切位点(C)和综合的剪切位点(Y)的最大分值均处于第22位谷氨酰胺,其值分别为0.810和0.856,因此NtBGl-1具有信号肽,剪切位点处于第21与22位氨基酸之间,信号肽处于第1~21位的氨基酸,该信号肽的均值为0.902;NtBGl-2的信号肽值于第20位亮氨酸处达到最大(0.957),原始的剪切位点和综合的剪切位点的最大分值均处于第33位谷氨酰胺,其值分别为0.742和0.795,即NtBGl-2具有信号肽,剪切位点处于第32~33位氨基酸,信号肽处于第1~32位的氨基酸,该信号肽的均值为0.846;NtBGl-3的信号肽值于第9位苯丙氨酸处达到最大(0.986),原始的剪切位点和综合的剪切位点的最大分值均处于第30位谷氨酰胺,其值分别为0.615和0.753,表明NtBGl-3具有信号肽,剪切位点处于第29与30位氨基酸之间, 且信号肽处于第1~29位的氨基酸,该信号肽的均值为0.929。综上所述,烟草葡聚糖酶均具有信号肽,即属于分泌蛋白。
2.3 烟草β-1,3-葡聚糖酶的跨膜结构分析
蛋白酶可通过跨膜结构锚定于质膜上,进而在亚细胞结构的特定区域参与信号传递或代谢活动,因此对NtBGl的跨膜结构进行分析,结果显示(图2),NtBGl-1序列位于膜内的氨基酸数为3.50,小于20.00,即NtBGl-1不具有跨膜结构;NtBGl-2和NtBGl-3位于膜内序列的氨基酸数分别为20.97和22.74,均大于20.00,表明NtBGl-2和NtBGl-3含有跨膜结构,其概率分别为0.947和0.993;NtBGl-2的第1~12位氨基酸位于
膜内,第13 ~35位氨基酸为跨膜区,第36~370位的氨基酸处于膜外;NtBGl-3的第1~6位氨基酸位于膜内,第7~29位氨基酸为跨膜区,第30~343位的氨基酸处于膜外。综上所述,除NtBGl-1外,NtBGl含有跨膜结构。
3 结论与讨论
通过理化特性分析,NtBGl-2等电点大于7.0,因此,NtBGl-2可能定位于液泡,且具有降解病原菌菌丝的功能[20],但NtBGl-2属于不稳定性蛋白,因此NtBGl-2可能诱导同工酶、几丁质、核糖体等共同作用,进行抵抗病原微生物[7-8];NtBGl均属于分泌蛋白,具有信号肽,从而指引烟草葡聚糖酶运输于特定区域,参与相应的抗性反应[21];NtBGl-2(第13 ~35位氨基酸)和NtBGl-3(7 ~29)均含有跨膜结构,因此,NtBGl-2和NtBGl-3可能参与信号的传递[22]。
参考文献
[1] 蒋选利,李振岐,康振生.β-1,3-葡聚糖酶与植物的抗病性[J].西北农业学报,2005, 14(4):135-139.
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[3] CHOURASIA A,SANE V A,SINGH R K,et al.Isolation and characterization of the MiCel1 gene from mango:Ripening related expression and enhanced endoglucanase activity during softening[J]. Plant growth regulation,2008,56(2):117-127.
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[9] LAWRENCE C B,SINGH N P,QIU J S,et al.Constitutive hydrolytic enzymes are associated with polygenic resistance of tomato to Alternaria solani and may function as an elicitor release mechanism[J]. Physiological &molecular pant pathology,2000,57(5):211-220.
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[11] REPKA V,TAMS L,FISCHEROV I,et al.Identification and partial characterization of beta1,3glucanase from virusinfected cucumber cotyledons[J].Acta virologica,1997, 41(1):35-39.
[12] KANG M K,PARK K S,CHOI D.Coordinated expression of defenserelated genes by TMV infection or salicylic acid treatment in tobacco[J].Molecules &cells,1998,8(4):388-392.
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[17] SEZUTSU H,KAJIWARA H,KOJIMA K,et al.Identification of four major hornet silk genes with a complex of alaninerich and serinerich sequences in Vespa simillima xanthoptera Cameron[J].Bioscience biotechnology &biochemistry,2007,71(11):2725-2734.
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[22] 方静平,苏亚春,游倩,等.甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析[J].生物信息学, 2012,10(3):199-207.