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摘要 以秘鲁野生细叶番茄为试材，采用不同植物激素组合及不同光照对比培养方法，对野生番茄愈伤组织诱导及愈伤生长特性进行了研究。结果表明，MS+6-BA （0.05～2.0 ） mg/L +NAA 0.5 mg/L、MS+NAA 0.5 mg/L或2，4-D 0.5 mg/L均可诱导叶片及茎段愈伤化。不同光照条件（强光、弱光及黑暗培养）下愈伤发生颜色变化。无论光照或暗培养，愈伤组织增生速度均较快，20 d生长量为原来的3～14倍。根据定性和定量调查确定MS+NAA 0.5 mg/L为秘鲁野生细叶番茄愈伤光培养或暗培养的适宜培养基。该研究为野生番茄在基因工程上的利用奠定了技术基础。
关键词 秘鲁野生细叶番茄;愈伤组织;植物激素;生长特性
中图分类号 S641.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）35-0047-03
番茄（Solanum lycopersicum L.）作为重要的蔬菜作物和模式植物，在诸多方面已有研究报道，如在生理生化上对于野生与栽培番茄的耐盐性研究[1-3];利用子叶和下胚轴等外植体诱导植株再生[4-5];在基因工程方面抗逆、抗病、耐储藏等基因的遗传定位、克隆[6-9];以及农杆菌介导的抗病、抗虫、耐盐、耐除草剂等基因的遗传转化[10-13]。栽培番茄通常具有较高的商品性状，但易受逆境胁迫和病虫侵害。而野生番茄则是抗病、耐盐、耐冷、耐贮藏等抗逆基因及抗线虫、晚疫病、病毒病等抗病虫基因的主要来源[7-8]。目前野生番茄的种类较多，如细叶番茄（S.pimpinellifolium）、秘鲁番茄（S.peruvianum）、多毛番茄（S.habrochaites）、潘那利番茄（S.pennellii）、小花番茄（S.neorickii）等[14]，其中细叶番茄生长于秘鲁，它和栽培番茄可以相互杂交，亲缘非常接近，是惟一表现出与栽培番茄有天然渐渗现象的野生种。该研究对秘鲁野生细叶番茄（S.pimpinellifolium）的愈伤组织培养特性进行研究，以期为野生番茄基因工程中的利用提供基础性资料。
1 材料与方法
1.1 植物材料 秘鲁野生细叶番茄（S.pimpinellifolium），来源于廊坊市农林科学院作物研究所。
1.2 培养基 愈伤诱导培养基参照文献[15-16]及多年组培经验设计，以MS为基本培养基，每升添加琼脂粉5.5 ～6.0 g，白糖30 g，调pH至5.8～6.0。愈伤组织诱导激素为6-BA、NAA和2，4-D。培养基编号及配方如下：① MS+ 6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.5 mg/L;② MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L;③ MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L;④ MS+NAA 0.5 mg/L;⑤ MS+2，4-D 0.5 mg/L。
1.3 方法 愈伤组织诱导培养基确立：利用野生细叶番茄组培苗叶片和茎段等外植体，放置于添加不同激素的培养基上，观察愈伤诱导及继代生长情况，筛选确立出愈伤培养的适宜培养基。
野生细叶番茄愈伤细胞生长速度量化调查：将番茄愈伤接种时先称重，接种到④和⑤中，每种培养基各接种4瓶，每瓶4团愈伤，接种后将愈伤团按重量由轻到重分别编号为1～16号。光照下（2 000 lx，12 h/d）培养20 d后再次称重，数据录入到Excel中进行分析，明确野生番茄固体培养的生长速度。
愈伤在不同光照条件下的生长特性研究：选择在同一培养基上（MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.5 mg/L）多次继代、颜色质地均匀的愈伤，接种到培养基④上，进行光照培养（2 000 lx，12 h/d）、弱光培养（500 lx，8 h/d）和暗培养（全天无光照）。培养20 d时，观察记录愈伤细胞颜色变化，接种后和调查时均拍照。
2 结果与分析
2.1 不同培养基愈伤诱导 叶片和茎段等外植体在上述培养基中会逐渐愈伤化，经在相同培养基上继代转接，①～⑤号培养基均可诱导愈伤组织产生（表1）。其中①和②③对比，①中的愈伤生长速度较快，细胞相对疏散，颜色为米黄色，②号淡绿色，③号愈伤最绿。④和⑤培养基对比，④上诱导的愈伤颜色为白绿色，生长速度相对较快。
在①～③中继代转接，14d后愈伤即长满瓶。①号中愈伤越来越疏松，颜色变浅，③号中愈伤较为致密、硬。这3种
培养均添加NAA0.5 mg/L，差别是6-BA浓度由0.05 mg/L→0.5 mg/L→2 mg/L。愈伤组织在④号和⑤培养基中继代转接，④号愈伤白中带绿;⑤号愈伤也微有绿色，有暗色細胞出现，表现水渍状。图中⑥是接种初愈伤形态及颜色。
2.2 野生细叶番茄愈伤细胞生长速度 光照下培养20 d后，1～16号愈伤团均按照接种初愈伤重量由轻到重排列。由图中数据分析可看出：不同愈伤团的净增长量存在差别，按照接种初重量由低到高升序排列，20 d后的重量却没有出现规则的升序排列状态。总体是：④生长量是原来的3～14倍，⑤生长量是原来的3～10倍。
取出愈伤破坏性调查：⑤上的愈伤水分含量高，水渍状;④相对较干，为湿沙状。从颜色看：⑤上的愈伤有较多变黑细胞;④细胞色浅，米白色，颜色相对均匀。综合分析，选择④作为番茄愈伤继代培养的适宜培养基。
2.3 不同光照下愈伤生长对比 愈伤组织在强光、弱光及完全黑暗培养20 d时调查，最初接种的浅白愈伤团表现出3种颜色：浅白色、暗黑色和黄褐色。变黑及褐化程度上：强光>弱光>全黑暗。强光下多数愈伤为白色，呈现黑色的极少，有个别愈伤团为微黄色。弱光及全黑暗白色愈伤相对少，黑化及褐化较多。3种光照条件下继续培养30 d，黑色及黄褐色进一步加深，有的整瓶愈伤变黑色或黄褐色。黑暗培养的愈伤挑选其中的色浅细胞转接继续暗培养，细胞生长出现好转，浅色多，也有微黑出现。 由不同光照下愈伤培养变化可以看出：经过20 d的培养，番茄愈伤在光照下培养，新生组织多为白色，少数出现黑色和乳黄色。在弱光或完全黑暗下，新生细胞黑色与浅色混杂，且黑色细胞较多，也有不发黑但为乳黄色的细胞团。挑选浅色细胞黑暗继代培养，经多次继代后可获得稳定的白色愈伤，不再发生颜色改变。
3 结论与讨论
秘鲁野生细叶番茄外植体愈伤诱导较易，NAA 0.5 mg/L单独使用或配合6-BA （0.05～ 2.0 mg/L）均可使叶片茎段等材料愈伤化，但随着6-BA浓度的升高，愈伤由松散变得致密，颜色由淡绿变为浓绿。
愈伤组织无论光照或暗培养，细胞增生速度均很快，20 d生长量为原来的3～14倍。根据定性和定量调查确定MS+NAA 0.5 mg/L为秘鲁野生细叶番茄愈伤光或暗培养的适宜培养基。光照条件下培养，新生组织多为白色，少数细胞团整体表现乳黄色。在弱光或完全黑暗条件下，新生细胞黑色与浅色混杂，也有不发黑但整体为乳黄色的细胞团。挑选浅色细胞团继代培养变黑现象减轻。白色和乳黄色细胞团为颗粒状，用镊子碰触有沙沙音;黑色细胞团为絮状，碰触无声音，初步判断细胞已死。细胞团出现整体而不是部分黑化及乳黄色，应该与某种物质的产生及传递有关，具体机制及原因不明。
愈伤在增生速度与颜色上出现的变化及差异，原因在于番茄愈伤由不同组织诱导出，细胞也处于混杂状态，因此，继代转接时需要进行筛选淘汰。经过筛选可获得增生稳定、颜色均一的愈伤。无论是光照培养或暗培养，细胞增生速度均很快，所以转接周期不宜太长，以15～20 d一个周期为宜。
参考文献
[1] 陈火英，张建华，钟建江，等.番茄愈伤组织和植株耐盐性的比较研究[J].上海交通大学学报（农业科学版），2001，19（1）：49-54.
[2] 张建华，刘风荣，陈火英.野生番茄和栽培番茄的耐盐差异性比较研究[J].上海交通大学学报（农业科学版），2006，24（6）：533-536，540.
[3] 敖雁，管永祥，孙云贺，等.基于离子稳态的野生与栽培番茄及其杂交F1的耐盐性差异[J].土壤学报， 2016，53（4）：1065-1073.
[4] GUBI J，LAJCHOV Z，FARAG J，et al.Effect of genotype and explant type on shoot regeneration in tomato （Lycopersicon esculentum Mill.） in vitro[J].Czech J Genet Plant Breed，2003，39（1）：9-14.
[5] 梁美霞.番茄子叶和下胚轴离体再生体系建立[J].中国农学通报，2010，26（6）：47-50.
[6] 李广存，毕玉平，李杰文，等.番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建[J].山东农业科学，1999，22（3）：19-22.
[7] 刘冰.野生醋栗番茄耐冷基因的渗入及遗传定位[D].北京：中国农业科学院，2009.
[8] 程希.番茄野生种及栽培种抗病同源基因的克隆与分析[D].武汉：华中农业大学，2010.
[9] 余庆辉.利用野生番茄Solanum pennellii LA716渐渗系群体进行番茄耐盐相关QTLs定位[D].南京：南京农业大学，2011.
[10] FILLATTI J J，KISER J，ROSE R，et al.Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector[J].Bio/Technol，1987，5（7）：726-730.
[11] FISCHHOFF D A，BOWDISH K S，PERLAK F J，et al.Insect tolerant transgenic tomato plants[J].Bio/Technol，1987，5（8）：807-813.
[12] GISBERT C，RUS M A，BOLARN C M，et al.The yeast HAL1 gene improves salt tolerance of transgenic tomato[J].Plant Physiol，2000，123（1）：393-402.
[13] JIA G X，ZHU Z Q，CHANG F Q，et al.Transformation of tomato with the BADH gene from Atriplex improves salt tolerance[J].Plant Cell Rep，2000，21（2）：141-146.
[14] 赵凌侠.番茄野生资源[M].上海：上海交通大学出版社，2012.
[15] 周金梅，宫敬利.不同培养基配方对L-402番茄愈傷组织的诱导研究[J].北方园艺，2010（21）：158-160.
[16] 马义勇，颜雪芬，刘思言，等.番茄愈伤组织诱导的初步研究[J].北方园艺，2012（6）：106-108.
关键词 秘鲁野生细叶番茄;愈伤组织;植物激素;生长特性
中图分类号 S641.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）35-0047-03
番茄（Solanum lycopersicum L.）作为重要的蔬菜作物和模式植物，在诸多方面已有研究报道，如在生理生化上对于野生与栽培番茄的耐盐性研究[1-3];利用子叶和下胚轴等外植体诱导植株再生[4-5];在基因工程方面抗逆、抗病、耐储藏等基因的遗传定位、克隆[6-9];以及农杆菌介导的抗病、抗虫、耐盐、耐除草剂等基因的遗传转化[10-13]。栽培番茄通常具有较高的商品性状，但易受逆境胁迫和病虫侵害。而野生番茄则是抗病、耐盐、耐冷、耐贮藏等抗逆基因及抗线虫、晚疫病、病毒病等抗病虫基因的主要来源[7-8]。目前野生番茄的种类较多，如细叶番茄（S.pimpinellifolium）、秘鲁番茄（S.peruvianum）、多毛番茄（S.habrochaites）、潘那利番茄（S.pennellii）、小花番茄（S.neorickii）等[14]，其中细叶番茄生长于秘鲁，它和栽培番茄可以相互杂交，亲缘非常接近，是惟一表现出与栽培番茄有天然渐渗现象的野生种。该研究对秘鲁野生细叶番茄（S.pimpinellifolium）的愈伤组织培养特性进行研究，以期为野生番茄基因工程中的利用提供基础性资料。
1 材料与方法
1.1 植物材料 秘鲁野生细叶番茄（S.pimpinellifolium），来源于廊坊市农林科学院作物研究所。
1.2 培养基 愈伤诱导培养基参照文献[15-16]及多年组培经验设计，以MS为基本培养基，每升添加琼脂粉5.5 ～6.0 g，白糖30 g，调pH至5.8～6.0。愈伤组织诱导激素为6-BA、NAA和2，4-D。培养基编号及配方如下：① MS+ 6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.5 mg/L;② MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L;③ MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L;④ MS+NAA 0.5 mg/L;⑤ MS+2，4-D 0.5 mg/L。
1.3 方法 愈伤组织诱导培养基确立：利用野生细叶番茄组培苗叶片和茎段等外植体，放置于添加不同激素的培养基上，观察愈伤诱导及继代生长情况，筛选确立出愈伤培养的适宜培养基。
野生细叶番茄愈伤细胞生长速度量化调查：将番茄愈伤接种时先称重，接种到④和⑤中，每种培养基各接种4瓶，每瓶4团愈伤，接种后将愈伤团按重量由轻到重分别编号为1～16号。光照下（2 000 lx，12 h/d）培养20 d后再次称重，数据录入到Excel中进行分析，明确野生番茄固体培养的生长速度。
愈伤在不同光照条件下的生长特性研究：选择在同一培养基上（MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.5 mg/L）多次继代、颜色质地均匀的愈伤，接种到培养基④上，进行光照培养（2 000 lx，12 h/d）、弱光培养（500 lx，8 h/d）和暗培养（全天无光照）。培养20 d时，观察记录愈伤细胞颜色变化，接种后和调查时均拍照。
2 结果与分析
2.1 不同培养基愈伤诱导 叶片和茎段等外植体在上述培养基中会逐渐愈伤化，经在相同培养基上继代转接，①～⑤号培养基均可诱导愈伤组织产生（表1）。其中①和②③对比，①中的愈伤生长速度较快，细胞相对疏散，颜色为米黄色，②号淡绿色，③号愈伤最绿。④和⑤培养基对比，④上诱导的愈伤颜色为白绿色，生长速度相对较快。
在①～③中继代转接，14d后愈伤即长满瓶。①号中愈伤越来越疏松，颜色变浅，③号中愈伤较为致密、硬。这3种
培养均添加NAA0.5 mg/L，差别是6-BA浓度由0.05 mg/L→0.5 mg/L→2 mg/L。愈伤组织在④号和⑤培养基中继代转接，④号愈伤白中带绿;⑤号愈伤也微有绿色，有暗色細胞出现，表现水渍状。图中⑥是接种初愈伤形态及颜色。
2.2 野生细叶番茄愈伤细胞生长速度 光照下培养20 d后，1～16号愈伤团均按照接种初愈伤重量由轻到重排列。由图中数据分析可看出：不同愈伤团的净增长量存在差别，按照接种初重量由低到高升序排列，20 d后的重量却没有出现规则的升序排列状态。总体是：④生长量是原来的3～14倍，⑤生长量是原来的3～10倍。
取出愈伤破坏性调查：⑤上的愈伤水分含量高，水渍状;④相对较干，为湿沙状。从颜色看：⑤上的愈伤有较多变黑细胞;④细胞色浅，米白色，颜色相对均匀。综合分析，选择④作为番茄愈伤继代培养的适宜培养基。
2.3 不同光照下愈伤生长对比 愈伤组织在强光、弱光及完全黑暗培养20 d时调查，最初接种的浅白愈伤团表现出3种颜色：浅白色、暗黑色和黄褐色。变黑及褐化程度上：强光>弱光>全黑暗。强光下多数愈伤为白色，呈现黑色的极少，有个别愈伤团为微黄色。弱光及全黑暗白色愈伤相对少，黑化及褐化较多。3种光照条件下继续培养30 d，黑色及黄褐色进一步加深，有的整瓶愈伤变黑色或黄褐色。黑暗培养的愈伤挑选其中的色浅细胞转接继续暗培养，细胞生长出现好转，浅色多，也有微黑出现。 由不同光照下愈伤培养变化可以看出：经过20 d的培养，番茄愈伤在光照下培养，新生组织多为白色，少数出现黑色和乳黄色。在弱光或完全黑暗下，新生细胞黑色与浅色混杂，且黑色细胞较多，也有不发黑但为乳黄色的细胞团。挑选浅色细胞黑暗继代培养，经多次继代后可获得稳定的白色愈伤，不再发生颜色改变。
3 结论与讨论
秘鲁野生细叶番茄外植体愈伤诱导较易，NAA 0.5 mg/L单独使用或配合6-BA （0.05～ 2.0 mg/L）均可使叶片茎段等材料愈伤化，但随着6-BA浓度的升高，愈伤由松散变得致密，颜色由淡绿变为浓绿。
愈伤组织无论光照或暗培养，细胞增生速度均很快，20 d生长量为原来的3～14倍。根据定性和定量调查确定MS+NAA 0.5 mg/L为秘鲁野生细叶番茄愈伤光或暗培养的适宜培养基。光照条件下培养，新生组织多为白色，少数细胞团整体表现乳黄色。在弱光或完全黑暗条件下，新生细胞黑色与浅色混杂，也有不发黑但整体为乳黄色的细胞团。挑选浅色细胞团继代培养变黑现象减轻。白色和乳黄色细胞团为颗粒状，用镊子碰触有沙沙音;黑色细胞团为絮状，碰触无声音，初步判断细胞已死。细胞团出现整体而不是部分黑化及乳黄色，应该与某种物质的产生及传递有关，具体机制及原因不明。
愈伤在增生速度与颜色上出现的变化及差异，原因在于番茄愈伤由不同组织诱导出，细胞也处于混杂状态，因此，继代转接时需要进行筛选淘汰。经过筛选可获得增生稳定、颜色均一的愈伤。无论是光照培养或暗培养，细胞增生速度均很快，所以转接周期不宜太长，以15～20 d一个周期为宜。
参考文献
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