【摘 要】
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目的建立一种灵敏、特异地检测肝组织中HBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法。方法利用HBV cccDNA与rcDNA结构上的差异,设计检测HBV cccDNA的特异性引物及探针,以含HBV基因组全
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目的建立一种灵敏、特异地检测肝组织中HBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法。方法利用HBV cccDNA与rcDNA结构上的差异,设计检测HBV cccDNA的特异性引物及探针,以含HBV基因组全序列的P1.2Ⅱ质粒为检测HBV cccDNA的标准品,建立标准曲线。肝组织标本中提取的DNA分为2等份,1份经质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切,作为检测HBV cccDNA的模板,另1份不酶切作为检测肝组织HBV DNA和β-actin的模板,分别进行肝组织HBV DNA和β-actin的定量测定,并以β-actin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和HBV DNA含量进行标准化。结果肝组织HBV tDNA的线性范围为7.41×10~6~2.66×1011拷贝数/mg(对数值:9.33±1.27),HBV cccDNA的线性范围为7.63×10~4~9.46×10~8拷贝数/mg(对数值:7.55±1.08)。HBV cccDNA含量:13.066±7.387拷贝数/cell,HBV tDNA含量:1 363.9±153.94拷贝数/cell;同一患者肝组织cccDNA含量与HBV tDNA含量比值为0.96%;肝组织HBV cccDNA与肝组织HBV tDNA呈显著正相关关系(r=0.859,P<0.01)。结论该实时荧光定量PCR法可以灵敏、特异地检测慢性乙型肝炎患者肝组织中的HBV cccDNA载量。
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