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摘要：通过对饲用L-色氨酸进行鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验），评价该饲料添加剂的潜在致突变性。饲用L-色氨酸在0.008～5.000 mg/皿的范围内分为5个剂量组，在加（ ）S9、不加（-）S9的情况下，以TA97、TA98、TA100、TA102为试验菌株进行Ames试验。以敌克松等作为阳性对照，灭菌水为空白对照，二甲基亚砜为溶剂对照，采用双盲法计算回复突变菌落数。结果表明，阳性对照试验各菌株反应合格；饲用L-色氨酸无论在加（ ）S9、不加（-）S9的情况下，4株试验菌的平均回变菌落数均小于阴性（溶剂）对照组的2倍，未见剂量-反应关系，且2次试验结果一致。饲用L-色氨酸的Ames试验结果为阴性，表明该饲料添加剂无体外致突变性。
关键词：L-色氨酸；Ames试验；饲料添加剂
中图分类号：S816.71文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0287-02
收稿日期：2015-03-23
基金项目：江苏高校优势学科建设工程项目；扬州大学新世纪人才工程。
作者简介：赵莎莎（1979—），女，江苏徐州人，讲师，主要从事实验室教学工作。E-mail：157568300@qq.com。
通信作者：张雨梅，博士，教授。E-mail：zym@yzu.edu.cn。L-色氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，参与机体蛋白质合成和营养代谢调节。色氨酸在体内合成极少，须从外界摄取满足机体需要。国内外在食品中已广泛将L-色氨酸作为食品添加剂，以强化对蛋白质的利用率，对于强化食品提高植物蛋白的利用率具有重要作用[1]。
L-色氨酸是继赖氨酸、蛋氨酸之后的又一个重要的饲料添加氨基酸。色氨酸的代谢产物5-羟基色氨酸在动物体内有抗高密度、断奶等应激作用，还能促进γ-球蛋白的产生、增强机体抗病能力[2-3]。在低蛋白饲料中添加色氨酸对改善饲料效率、提高畜禽增重和家禽生产性能[4-6]、增强免疫机能十分有效[7-10]。Li等在饲料中添加0.04% L-色氨酸可显著提高蛋雏鸭平均日增质量、饲料转化率[6]。周斌等研究发现，在含0.06% L-色氨酸的日粮中额外添加0.03%、 0.06% 、0.09% L-色氨酸，可显著提高0～3周龄肉仔鸡平均日增质量[7]。L-色氨酸有促进骨髓T 淋巴细胞前体分化为成熟T 淋巴细胞，具有免疫增强作用[11-12]，L-色氨酸缺乏则会导致体液免疫功能降低[13]。鸡饲料中添加L-色氨酸可显著提高α干扰素、γ干扰素和IgG水平，同时在传染性法氏囊病免疫方面作用显著。
在蛋雏鸭饲料中添加0.04% L-色氨酸可显著提高蛋雏鸭脾脏指数，添加 0.06% L-色氨酸可显著提高蛋雏鸭胸腺指数。由于L-色氨酸生产工艺不断改进、生产成本逐渐降低，其作为饲料添加剂在畜禽生产中的应用越来越广泛。本研究通过鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）评价某企业新的生产工艺生产的饲用L-色氨酸的致突变性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1受试物及溶液配制饲用20%L-色氨酸，批号20130409，黄色颗粒，由浙江某生物股份有限公司提供。
饲用L-色氨酸充分研磨后，称取5.00 g溶于100 mL灭菌蒸馏水中。用直径50 mm 的无菌滤膜（孔径0.22 μm）过滤除菌，用灭菌蒸馏水梯度稀释至所需浓度，现配现用。
阳性对照物：2-氨基芴（2-AF），纯度>99%，日本东京化成工业株式会社；敌克松，纯度98.8%，美国DIMA技术有限公司；4-硝基喹啉-N-氧化物、甲基磺酸甲酯，纯度均大于98%，美国Amresco公司；多氯联苯（Aroclor1254），美国Crescent Chemical 有限公司。阳性对照物均用二甲基亚砜作为溶剂配制成相关浓度。
1.1.2试验菌株TA97、TA98、TA100、TA102菌株由江苏省疾病控制中心提供，-80 ℃保存。试验菌株生物学特性按GB 15193.4—2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》标准方法鉴定，符合试验要求。
1.2试验方法
1.2.1大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备雄性成年Wistar大鼠2只，多氯联苯（Aroclor1254）溶于玉米油中制成200 mg/mL溶液，按500 mg/kg腹腔注射作为诱导剂。按GB 15193.4—2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》方法制备S9，生物活性鉴定合格后，-80 ℃保存备用。
1.2.2平板掺入法Ames试验根据预试验结果，受试物饲用L-色氨酸的剂量设置分别为5.00、1.00、0.20、0.04、 8.0 0 μg/皿 ；另设阴性（溶剂）对照组和阳性对照组，每个试验组分加（ ）S9、不加（-）S9等2个系列，每个系列设3个平行平皿。阳性对照组：加S9 时，4株菌株均用2-氨基芴（2-AF），浓度为100 μg/mL[0.1 μg/（μL·皿）]；不加S9时，TA97、TA98用敌克松，浓度为0.5 mg/mL[0.5 μg/（μL·皿）] ，TA100用4-硝基喹啉-N-氧化物，浓度为5 μg/mL[0.005 μg/（μL·皿）]，TA102用甲基磺酸甲酯，浓度为 10 μg/mL[0.01 μg/（μL·皿）]。
双盲法记录每皿回变菌落数。按GB 15193.4—2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》的标准判定Ames试验结果为阴性或阳性。
1.2.3观察指标整个试验过程中需观察试验菌是否正常生长，阴性对照组每皿自发回变菌落数是否在正常范围，阳性对照试验各菌株反应是否合格。
双盲法记录受试物各剂量组、阳性对照组、溶剂对照组和空白对照（自发回变）的每皿回变菌落数。 1.2.4结果判定如果受试物的回变菌落数是溶剂对照组回变菌落数的2倍或2倍以上、受试品的回复突变数的增加与剂量相关并有统计学意义、某一剂量组呈现可重复的回复突变数增加并有统计学意义，则判为诱变阳性（有致突变作用），反之为阴性。
2结果与分析
4种试验用鼠伤寒沙门氏菌株菌苔生长正常，阳性对照试验各菌株反应合格。2次重复试验结果见表1、表2。
3结论与讨论
在本研究中，饲用L-色氨酸饲料添加剂的鼠伤寒沙门氏菌突变试验结果为阴性，表明饲用L-色氨酸饲料添加剂对鼠伤寒沙门氏菌试验株无致突变性。
Ames试验是遗传毒理学的一种体外试验，遗传学终点是基因突变，用于检测受试物能否引起鼠伤寒沙门氏菌基因组碱基置换或移码突变。如果对饲用L-色氨酸进一步进行小鼠微核试验、精子畸形试验、染色体畸变试验、姊妹染色体交换试验或显性致死试验，则可以更全面地评价其致突变作用。
参考文献：
[1]李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化作用及其应用[J]. 氨基酸和生物资源，2005，27（3）：58-62.
[2]徐洪利，赵斐，左良成，等. 饲用色氨酸应用研究进展[J]. 安徽农业科学，2013（ 13）：5750-5752.
[3]Leuchtenberger W，Huthmacher K，Drauz K. Biotechnological production of amino acids and derivatives：current status and prospects[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2005，69（1）：1-8.
[4]Ettle T，Roth F X. Specific dietary selection for tryptophan by the piglet[J]. Journal of Animal Science，2004，82（4）：1115-1121.
[5]王荣发，李敏，贺喜等. 低蛋白质饲粮条件下生长猪对色氨酸需要量的研究[J]. 动物营养学报，2011（23）：1669-1676.
[6]Li Y Z，Kerr B J，Kidd M T，et al. Use of supplementary tryptophan to modify the behavior of pigs[J]. Journal of Animal Science，2006，84（1）：212-220.
[7]周斌，李慧，邹晓庭，等. 色氨酸对产蛋鸡脂肪代谢的影响[J]. 中国畜牧杂志，2011，47（7）：50-53.
[8]韩旭峰，高玉鹏，侯水生，等. 1～14 日龄北京鸭色氨酸需要量的研究[J]. 中国饲料，2009（22）：22-23.
[9]刘肖挺，王安，杨小燕，等. 色氨酸对蛋雏鸭生长性能和营养物
质代谢影响[J]. 中国饲料，2012，（19）：22-25.
[10]王鹏，王安，李丽娟.饲粮中色氨酸对0～3 周龄肉仔鸡生长性能及血液生化指标的影响[J]. 饲料工业，2010，31（20）：8-11.
[11]程镇燕，陈韶阳，乔秀亭.鱼类功能性氨基酸营养免疫研究进展[J]. 饲料研究，2014（9）：52-57.
[12]Lepage O，Tottmar O，Winberg S. Elevated dietary intake of L-tryptophan counteracts the stress-induced elevation of plasma cortisol in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）[J]. The Journal of Experimental Biology，2002，205（Pt 23）：3679-3687.
[13]Koopmans S J，Ruis M，Dekker R，et al. Surplus dietary tryptophan reduces plasma cortisol and noradrenaline concentrations and enhances recovery after social stress in pigs[J]. Physiology
关键词：L-色氨酸；Ames试验；饲料添加剂
中图分类号：S816.71文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0287-02
收稿日期：2015-03-23
基金项目：江苏高校优势学科建设工程项目；扬州大学新世纪人才工程。
作者简介：赵莎莎（1979—），女，江苏徐州人，讲师，主要从事实验室教学工作。E-mail：157568300@qq.com。
通信作者：张雨梅，博士，教授。E-mail：zym@yzu.edu.cn。L-色氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，参与机体蛋白质合成和营养代谢调节。色氨酸在体内合成极少，须从外界摄取满足机体需要。国内外在食品中已广泛将L-色氨酸作为食品添加剂，以强化对蛋白质的利用率，对于强化食品提高植物蛋白的利用率具有重要作用[1]。
L-色氨酸是继赖氨酸、蛋氨酸之后的又一个重要的饲料添加氨基酸。色氨酸的代谢产物5-羟基色氨酸在动物体内有抗高密度、断奶等应激作用，还能促进γ-球蛋白的产生、增强机体抗病能力[2-3]。在低蛋白饲料中添加色氨酸对改善饲料效率、提高畜禽增重和家禽生产性能[4-6]、增强免疫机能十分有效[7-10]。Li等在饲料中添加0.04% L-色氨酸可显著提高蛋雏鸭平均日增质量、饲料转化率[6]。周斌等研究发现，在含0.06% L-色氨酸的日粮中额外添加0.03%、 0.06% 、0.09% L-色氨酸，可显著提高0～3周龄肉仔鸡平均日增质量[7]。L-色氨酸有促进骨髓T 淋巴细胞前体分化为成熟T 淋巴细胞，具有免疫增强作用[11-12]，L-色氨酸缺乏则会导致体液免疫功能降低[13]。鸡饲料中添加L-色氨酸可显著提高α干扰素、γ干扰素和IgG水平，同时在传染性法氏囊病免疫方面作用显著。
在蛋雏鸭饲料中添加0.04% L-色氨酸可显著提高蛋雏鸭脾脏指数，添加 0.06% L-色氨酸可显著提高蛋雏鸭胸腺指数。由于L-色氨酸生产工艺不断改进、生产成本逐渐降低，其作为饲料添加剂在畜禽生产中的应用越来越广泛。本研究通过鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）评价某企业新的生产工艺生产的饲用L-色氨酸的致突变性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1受试物及溶液配制饲用20%L-色氨酸，批号20130409，黄色颗粒，由浙江某生物股份有限公司提供。
饲用L-色氨酸充分研磨后，称取5.00 g溶于100 mL灭菌蒸馏水中。用直径50 mm 的无菌滤膜（孔径0.22 μm）过滤除菌，用灭菌蒸馏水梯度稀释至所需浓度，现配现用。
阳性对照物：2-氨基芴（2-AF），纯度>99%，日本东京化成工业株式会社；敌克松，纯度98.8%，美国DIMA技术有限公司；4-硝基喹啉-N-氧化物、甲基磺酸甲酯，纯度均大于98%，美国Amresco公司；多氯联苯（Aroclor1254），美国Crescent Chemical 有限公司。阳性对照物均用二甲基亚砜作为溶剂配制成相关浓度。
1.1.2试验菌株TA97、TA98、TA100、TA102菌株由江苏省疾病控制中心提供，-80 ℃保存。试验菌株生物学特性按GB 15193.4—2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》标准方法鉴定，符合试验要求。
1.2试验方法
1.2.1大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备雄性成年Wistar大鼠2只，多氯联苯（Aroclor1254）溶于玉米油中制成200 mg/mL溶液，按500 mg/kg腹腔注射作为诱导剂。按GB 15193.4—2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》方法制备S9，生物活性鉴定合格后，-80 ℃保存备用。
1.2.2平板掺入法Ames试验根据预试验结果，受试物饲用L-色氨酸的剂量设置分别为5.00、1.00、0.20、0.04、 8.0 0 μg/皿 ；另设阴性（溶剂）对照组和阳性对照组，每个试验组分加（ ）S9、不加（-）S9等2个系列，每个系列设3个平行平皿。阳性对照组：加S9 时，4株菌株均用2-氨基芴（2-AF），浓度为100 μg/mL[0.1 μg/（μL·皿）]；不加S9时，TA97、TA98用敌克松，浓度为0.5 mg/mL[0.5 μg/（μL·皿）] ，TA100用4-硝基喹啉-N-氧化物，浓度为5 μg/mL[0.005 μg/（μL·皿）]，TA102用甲基磺酸甲酯，浓度为 10 μg/mL[0.01 μg/（μL·皿）]。
双盲法记录每皿回变菌落数。按GB 15193.4—2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》的标准判定Ames试验结果为阴性或阳性。
1.2.3观察指标整个试验过程中需观察试验菌是否正常生长，阴性对照组每皿自发回变菌落数是否在正常范围，阳性对照试验各菌株反应是否合格。
双盲法记录受试物各剂量组、阳性对照组、溶剂对照组和空白对照（自发回变）的每皿回变菌落数。 1.2.4结果判定如果受试物的回变菌落数是溶剂对照组回变菌落数的2倍或2倍以上、受试品的回复突变数的增加与剂量相关并有统计学意义、某一剂量组呈现可重复的回复突变数增加并有统计学意义，则判为诱变阳性（有致突变作用），反之为阴性。
2结果与分析
4种试验用鼠伤寒沙门氏菌株菌苔生长正常，阳性对照试验各菌株反应合格。2次重复试验结果见表1、表2。
3结论与讨论
在本研究中，饲用L-色氨酸饲料添加剂的鼠伤寒沙门氏菌突变试验结果为阴性，表明饲用L-色氨酸饲料添加剂对鼠伤寒沙门氏菌试验株无致突变性。
Ames试验是遗传毒理学的一种体外试验，遗传学终点是基因突变，用于检测受试物能否引起鼠伤寒沙门氏菌基因组碱基置换或移码突变。如果对饲用L-色氨酸进一步进行小鼠微核试验、精子畸形试验、染色体畸变试验、姊妹染色体交换试验或显性致死试验，则可以更全面地评价其致突变作用。
参考文献：
[1]李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化作用及其应用[J]. 氨基酸和生物资源，2005，27（3）：58-62.
[2]徐洪利，赵斐，左良成，等. 饲用色氨酸应用研究进展[J]. 安徽农业科学，2013（ 13）：5750-5752.
[3]Leuchtenberger W，Huthmacher K，Drauz K. Biotechnological production of amino acids and derivatives：current status and prospects[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2005，69（1）：1-8.
[4]Ettle T，Roth F X. Specific dietary selection for tryptophan by the piglet[J]. Journal of Animal Science，2004，82（4）：1115-1121.
[5]王荣发，李敏，贺喜等. 低蛋白质饲粮条件下生长猪对色氨酸需要量的研究[J]. 动物营养学报，2011（23）：1669-1676.
[6]Li Y Z，Kerr B J，Kidd M T，et al. Use of supplementary tryptophan to modify the behavior of pigs[J]. Journal of Animal Science，2006，84（1）：212-220.
[7]周斌，李慧，邹晓庭，等. 色氨酸对产蛋鸡脂肪代谢的影响[J]. 中国畜牧杂志，2011，47（7）：50-53.
[8]韩旭峰，高玉鹏，侯水生，等. 1～14 日龄北京鸭色氨酸需要量的研究[J]. 中国饲料，2009（22）：22-23.
[9]刘肖挺，王安，杨小燕，等. 色氨酸对蛋雏鸭生长性能和营养物
质代谢影响[J]. 中国饲料，2012，（19）：22-25.
[10]王鹏，王安，李丽娟.饲粮中色氨酸对0～3 周龄肉仔鸡生长性能及血液生化指标的影响[J]. 饲料工业，2010，31（20）：8-11.
[11]程镇燕，陈韶阳，乔秀亭.鱼类功能性氨基酸营养免疫研究进展[J]. 饲料研究，2014（9）：52-57.
[12]Lepage O，Tottmar O，Winberg S. Elevated dietary intake of L-tryptophan counteracts the stress-induced elevation of plasma cortisol in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）[J]. The Journal of Experimental Biology，2002，205（Pt 23）：3679-3687.
[13]Koopmans S J，Ruis M，Dekker R，et al. Surplus dietary tryptophan reduces plasma cortisol and noradrenaline concentrations and enhances recovery after social stress in pigs[J]. Physiology