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1 试验材料与方法
1.1.1 试验动物及试验黄橙素
试验所用新吉富罗非鱼由福建省淡水水产研究所闽侯试验基地提供（体重28.5±3g）;黄橙素由北京生泰尔生物制药有限公司提供。
1.1.2 试验饲料
饲料按照上表配制基础饲料，采用单因子浓度梯度法，将黄橙素以添加量为500mg·kg-1、1000mg·kg-1、1500mg·kg-1和2000mg·kg-1添加到基础饲料中逐渐增加的添加量配制试验组饲料，以未添加黄橙素的基础饲料做为对照组饲料，混合均匀后，经小型膨化颗粒饲料机加工成3mm×2mm的颗粒饲料，利用阳光和烘干设备使饲料的含水量低于10%，密封保存备用，颗粒饲料的各种营养成分见表1。
1.1.3 试验设计及饲养管理
将购回的新吉富罗非鱼于大水泥池中暂养10d左右，待试验鱼各方面稳定后，挑选规格相近的新吉富罗非鱼共500尾，选择体重差异不显著分为10个水泥池（50尾/池），池子配有渔网、体积为1m3，试验分为5组，即对照组、500mg·kg-1、1000mg·kg-1、1500mg·kg-1和2000mg·kg-1，每组各设2个平行，10个池随机标记分组。待罗非鱼稳定后，投喂不同黄橙素水平的试验饲料和对照饲料。实验前对鱼池用1ppm的PVP-I连续4天每天消毒一次，试验开始第一周采用1‰浓度的盐水消毒，各组水质均采用曝气过的自水。每天早上8点和下午4点分别饲喂和换水一次，投喂量分别为各组新吉富罗非鱼总体重的2%-4%，换水量约为水泥池水量的30%。试验不间断进行60天，试验期间不间断使用增氧机充氧，热水棒控温，使水温恒定在28℃左右。
1.2 试验仪器与试剂
仪器：烘箱、石蜡切片机（Leica，RM2235）、显微镜（Leica，DM2135）、水浴锅等
试剂：苏木精-伊红染液试剂盒、4%的多聚甲醛固定液、切片石蜡（熔点54-56℃）。
1.3 试验操作步骤
1.3.1 取材与固定
第60d的前一天对各个试验组罗非鱼饥饿处理，60d时，随机从每个池中抽取6尾罗非鱼，常规解剖，取出罗非鱼的内脏，分离出肠道取长度约1cm的前、中、后肠段，剥离肠道外壁上的杂质（注意保持肠管的完整），入pH=7.26的磷酸盐缓冲液中清洗肠道内容物，固定于预先配备的4%的多聚甲醛固定液中备用。
1.3.2 组织蜡块的制作
采用酒精对组织脱水，苯作为组织透明剂，包埋的石蜡熔点为54-56℃。将固定好的组织块修块，置于70%的酒精中过夜，第二天取出经过下列过程包埋为蜡块：
1.3.3 切片的制作
调节莱卡切片机至厚度为5μm来制作肠道的横断面切片，每隔3-6张取2片，以蛋白甘油作为粘片剂抹片，恒温水浴锅45℃温水展片，并在切片磨砂面上做好标记，将粘好的组织玻片置于40℃恒温箱中烘干为止，常温下保存备用待染。
1.4 肠道形态染色方法
1.4.1 脱蜡、水化：将上述切片分别浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ30min和20min，再以脱水的酒精梯度下行浸入50%乙醇后，浸入蒸馏水中待染;
1.4.2 HE染色：从蒸馏水中取出切片入蘇木精染液染2-4min，取出流水冲洗去除染液，蒸馏水洗30s左右，再用1%的盐酸酒精分色几秒（具体时间以镜检染色效果来定），自来水蓝化5min，蒸馏水洗后浸入伊红染液中20s左右，清水清洗，70%酒精分色，置入40℃烘箱中烘干;
1.4.3 封片：采用中性树胶封片（中性树胶中含有二甲苯因此不需要透明），待检。
1.5 肠绒毛的形态观察和测量
Leica显微镜下观察肠道整体形态结构。采用显微摄像观察、测量各组罗非鱼的肠绒毛长度和肌层厚度。每片肠道组织切片选择5张染色效果较佳的进行拍摄，每张图片随机选择5条均匀的肠绒毛和随机5处肌层厚度进行测量，并记录。
1.6 数据处理
应用EXCEL软件对数据进行管理，用SPSS 13.0软件进行分析，分析过程为Analyze→Conmpare Mean→One-Way ANOVA，结果采用±SD表示。
2 结果与分析
2.1 黄橙素对罗非鱼肠绒毛长度、肌层厚度的影响结果
2.1.1 各组罗非鱼肠绒毛长度变化的分析
显微镜下观察罗非鱼肠道的形态结构，各组罗非鱼肠绒毛排列整齐，肌层厚度均匀，粘膜层完整，肠绒毛柱状细胞排列紧密。黄橙素对罗非鱼肠道绒毛长度的影响见表2，数据分析结果表明：罗非鱼饲料中添加黄橙素能极显著的增加罗非鱼的前肠、中肠、后肠的肠道绒毛长度（P<0.01）。添加量为1000mg·kg-1、1500 mg·kg-1和2000 mg·kg-1试验组的前肠绒毛长度与对照组差异极显著（P<0.01），绒毛长度分别增加了14.92μm、25.84μm和12.07μm;相对于中肠来，添加量为1500 mg·kg-1和2000 mg·kg-1试验组与对照组差异极显著（P<0.01）的结果，绒毛长度的增加量分别为33.84μm和16.94μm;在后肠的各个试验组中，仅有1500mg·kg-1于对照组相比达到了差异极显著（P<0.01）的效果，增加量为21.45μm，其他组差异不显著（P>0.05）。同时，由表中数据可得，在同一处理组中，罗非鱼肠道绒毛的长度由前到后逐渐降低，前肠绒毛长度最长，中肠次之，后肠最短。
2.1.2各组罗非鱼肠道肌层厚度变化的分析
由表2可知，随着基础饲料中黄橙素添加量的增加，试验所取的3个不同肠段肌层厚度呈现先增加后降低的趋势，并且对罗非鱼的前、中、后肠肌层厚度的增加都达到了极显著的效果（P<0.01）。在前肠中，添加剂量为1000mg·kg-1的试验组与对照组差异极显著（P<0.01），厚度增加了9.98μm，其他处理组与对照组没有显著的差异;在中肠中，添加量为1000mg·kg-1何1500 mg·kg-1的试验组肌层厚度极显著高于对照组（P<0.01），增加量分别为30.1μm和16.92μm，添加量为500 mg·kg-1的试验组与对照组差异显著（P<0.05），差异量为9.22μm;后肠肌层厚度仅添加量为1500 mg·kg-1的试验组极显著高于对照组（P<0.01），增加了21.45μm，其他组与对照组差异不显著（P>0.05）。从对肌层厚度影响的试验效果来看，以添加量为1000mg·kg-1为佳。1500mg·kg-1次之。
3 讨 论
小肠在动物生长中起着重要的作用，食物经过胃的初步消化进入其中，进一步的消化，是吸收营养物质的主要部位，小肠的的正常生理活动决定于肠道粘膜是否完整，小肠壁有粘膜层、粘膜下层、肌肉层和浆膜层组成，粘膜层对于肠道的吸收占有极重要的地位，小肠的粘膜层上皮形成许多指状突起，即肠绒毛，肠绒毛形成的褶皱能够增大肠腔于食物的接触面积;肠绒毛是由单层柱状上皮细胞和固有膜组成，其主要细胞是柱状吸收细胞（又称肠细胞），占上皮细胞总数的90%左右。肠绒毛在小肠粘膜吸收营养物质中起到了至关重要作用，肠道中绒毛长度和肌层厚度的的变化改变了肠道粘膜层的厚度，影响其接触食物的表面积，从而影响肠道对营养物质消化和吸收的总量。鱼类的肠道组织结构分化不如高等动物的来的明显，但基本形态及主要功能是基本上一致的。
本试验研究饲料中添加不同添加剂量的黄橙素对罗非鱼前、中、后肠的绒毛长度、肌层厚度的影响，分析黄橙素对罗非鱼肠道结构的影响。试验结果表明：黄橙素对罗非鱼的肠绒毛长度和肌层厚度的生长具有一定的促进作用，肠绒毛长度以添加量为1500mg·kg-1试验组最佳，1000mg·kg-1次之，对肌层厚度的提高作用以添加量为1000mg·kg-1为佳。1500mg·kg-1次之，所以添加量应在1000-1500mg·kg-1之间。粘膜层厚度直接影响营养物质的吸收和转运，试验中黄橙素具有促进绒毛长度和肌层厚度生长的功能，增加了肠道吸收营养物质的表面积和粘膜层的厚度，促进动物的生长。
资助项目：
福建农林大学2016年度（第一批）科技创新专项基金项目（项目编号：CXZX2016011）
（作者单位：福建农林大学动物科学学院（蜂学学院））
1.1.1 试验动物及试验黄橙素
试验所用新吉富罗非鱼由福建省淡水水产研究所闽侯试验基地提供（体重28.5±3g）;黄橙素由北京生泰尔生物制药有限公司提供。
1.1.2 试验饲料
饲料按照上表配制基础饲料，采用单因子浓度梯度法，将黄橙素以添加量为500mg·kg-1、1000mg·kg-1、1500mg·kg-1和2000mg·kg-1添加到基础饲料中逐渐增加的添加量配制试验组饲料，以未添加黄橙素的基础饲料做为对照组饲料，混合均匀后，经小型膨化颗粒饲料机加工成3mm×2mm的颗粒饲料，利用阳光和烘干设备使饲料的含水量低于10%，密封保存备用，颗粒饲料的各种营养成分见表1。
1.1.3 试验设计及饲养管理
将购回的新吉富罗非鱼于大水泥池中暂养10d左右，待试验鱼各方面稳定后，挑选规格相近的新吉富罗非鱼共500尾，选择体重差异不显著分为10个水泥池（50尾/池），池子配有渔网、体积为1m3，试验分为5组，即对照组、500mg·kg-1、1000mg·kg-1、1500mg·kg-1和2000mg·kg-1，每组各设2个平行，10个池随机标记分组。待罗非鱼稳定后，投喂不同黄橙素水平的试验饲料和对照饲料。实验前对鱼池用1ppm的PVP-I连续4天每天消毒一次，试验开始第一周采用1‰浓度的盐水消毒，各组水质均采用曝气过的自水。每天早上8点和下午4点分别饲喂和换水一次，投喂量分别为各组新吉富罗非鱼总体重的2%-4%，换水量约为水泥池水量的30%。试验不间断进行60天，试验期间不间断使用增氧机充氧，热水棒控温，使水温恒定在28℃左右。
1.2 试验仪器与试剂
仪器：烘箱、石蜡切片机（Leica，RM2235）、显微镜（Leica，DM2135）、水浴锅等
试剂：苏木精-伊红染液试剂盒、4%的多聚甲醛固定液、切片石蜡（熔点54-56℃）。
1.3 试验操作步骤
1.3.1 取材与固定
第60d的前一天对各个试验组罗非鱼饥饿处理，60d时，随机从每个池中抽取6尾罗非鱼，常规解剖，取出罗非鱼的内脏，分离出肠道取长度约1cm的前、中、后肠段，剥离肠道外壁上的杂质（注意保持肠管的完整），入pH=7.26的磷酸盐缓冲液中清洗肠道内容物，固定于预先配备的4%的多聚甲醛固定液中备用。
1.3.2 组织蜡块的制作
采用酒精对组织脱水，苯作为组织透明剂，包埋的石蜡熔点为54-56℃。将固定好的组织块修块，置于70%的酒精中过夜，第二天取出经过下列过程包埋为蜡块：
1.3.3 切片的制作
调节莱卡切片机至厚度为5μm来制作肠道的横断面切片，每隔3-6张取2片，以蛋白甘油作为粘片剂抹片，恒温水浴锅45℃温水展片，并在切片磨砂面上做好标记，将粘好的组织玻片置于40℃恒温箱中烘干为止，常温下保存备用待染。
1.4 肠道形态染色方法
1.4.1 脱蜡、水化：将上述切片分别浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ30min和20min，再以脱水的酒精梯度下行浸入50%乙醇后，浸入蒸馏水中待染;
1.4.2 HE染色：从蒸馏水中取出切片入蘇木精染液染2-4min，取出流水冲洗去除染液，蒸馏水洗30s左右，再用1%的盐酸酒精分色几秒（具体时间以镜检染色效果来定），自来水蓝化5min，蒸馏水洗后浸入伊红染液中20s左右，清水清洗，70%酒精分色，置入40℃烘箱中烘干;
1.4.3 封片：采用中性树胶封片（中性树胶中含有二甲苯因此不需要透明），待检。
1.5 肠绒毛的形态观察和测量
Leica显微镜下观察肠道整体形态结构。采用显微摄像观察、测量各组罗非鱼的肠绒毛长度和肌层厚度。每片肠道组织切片选择5张染色效果较佳的进行拍摄，每张图片随机选择5条均匀的肠绒毛和随机5处肌层厚度进行测量，并记录。
1.6 数据处理
应用EXCEL软件对数据进行管理，用SPSS 13.0软件进行分析，分析过程为Analyze→Conmpare Mean→One-Way ANOVA，结果采用±SD表示。
2 结果与分析
2.1 黄橙素对罗非鱼肠绒毛长度、肌层厚度的影响结果
2.1.1 各组罗非鱼肠绒毛长度变化的分析
显微镜下观察罗非鱼肠道的形态结构，各组罗非鱼肠绒毛排列整齐，肌层厚度均匀，粘膜层完整，肠绒毛柱状细胞排列紧密。黄橙素对罗非鱼肠道绒毛长度的影响见表2，数据分析结果表明：罗非鱼饲料中添加黄橙素能极显著的增加罗非鱼的前肠、中肠、后肠的肠道绒毛长度（P<0.01）。添加量为1000mg·kg-1、1500 mg·kg-1和2000 mg·kg-1试验组的前肠绒毛长度与对照组差异极显著（P<0.01），绒毛长度分别增加了14.92μm、25.84μm和12.07μm;相对于中肠来，添加量为1500 mg·kg-1和2000 mg·kg-1试验组与对照组差异极显著（P<0.01）的结果，绒毛长度的增加量分别为33.84μm和16.94μm;在后肠的各个试验组中，仅有1500mg·kg-1于对照组相比达到了差异极显著（P<0.01）的效果，增加量为21.45μm，其他组差异不显著（P>0.05）。同时，由表中数据可得，在同一处理组中，罗非鱼肠道绒毛的长度由前到后逐渐降低，前肠绒毛长度最长，中肠次之，后肠最短。
2.1.2各组罗非鱼肠道肌层厚度变化的分析
由表2可知，随着基础饲料中黄橙素添加量的增加，试验所取的3个不同肠段肌层厚度呈现先增加后降低的趋势，并且对罗非鱼的前、中、后肠肌层厚度的增加都达到了极显著的效果（P<0.01）。在前肠中，添加剂量为1000mg·kg-1的试验组与对照组差异极显著（P<0.01），厚度增加了9.98μm，其他处理组与对照组没有显著的差异;在中肠中，添加量为1000mg·kg-1何1500 mg·kg-1的试验组肌层厚度极显著高于对照组（P<0.01），增加量分别为30.1μm和16.92μm，添加量为500 mg·kg-1的试验组与对照组差异显著（P<0.05），差异量为9.22μm;后肠肌层厚度仅添加量为1500 mg·kg-1的试验组极显著高于对照组（P<0.01），增加了21.45μm，其他组与对照组差异不显著（P>0.05）。从对肌层厚度影响的试验效果来看，以添加量为1000mg·kg-1为佳。1500mg·kg-1次之。
3 讨 论
小肠在动物生长中起着重要的作用，食物经过胃的初步消化进入其中，进一步的消化，是吸收营养物质的主要部位，小肠的的正常生理活动决定于肠道粘膜是否完整，小肠壁有粘膜层、粘膜下层、肌肉层和浆膜层组成，粘膜层对于肠道的吸收占有极重要的地位，小肠的粘膜层上皮形成许多指状突起，即肠绒毛，肠绒毛形成的褶皱能够增大肠腔于食物的接触面积;肠绒毛是由单层柱状上皮细胞和固有膜组成，其主要细胞是柱状吸收细胞（又称肠细胞），占上皮细胞总数的90%左右。肠绒毛在小肠粘膜吸收营养物质中起到了至关重要作用，肠道中绒毛长度和肌层厚度的的变化改变了肠道粘膜层的厚度，影响其接触食物的表面积，从而影响肠道对营养物质消化和吸收的总量。鱼类的肠道组织结构分化不如高等动物的来的明显，但基本形态及主要功能是基本上一致的。
本试验研究饲料中添加不同添加剂量的黄橙素对罗非鱼前、中、后肠的绒毛长度、肌层厚度的影响，分析黄橙素对罗非鱼肠道结构的影响。试验结果表明：黄橙素对罗非鱼的肠绒毛长度和肌层厚度的生长具有一定的促进作用，肠绒毛长度以添加量为1500mg·kg-1试验组最佳，1000mg·kg-1次之，对肌层厚度的提高作用以添加量为1000mg·kg-1为佳。1500mg·kg-1次之，所以添加量应在1000-1500mg·kg-1之间。粘膜层厚度直接影响营养物质的吸收和转运，试验中黄橙素具有促进绒毛长度和肌层厚度生长的功能，增加了肠道吸收营养物质的表面积和粘膜层的厚度，促进动物的生长。
资助项目：
福建农林大学2016年度（第一批）科技创新专项基金项目（项目编号：CXZX2016011）
（作者单位：福建农林大学动物科学学院（蜂学学院））