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摘要：以仿生态养殖和温室养殖的中华鳖为研究对象，探讨强制休眠和嗜水气单胞菌暴露对2种模式养成的中华鳖血清非特异性免疫的影响，研究发现，相同条件下，仿生态养殖中华鳖血清T-AOC活性显著高于温室养殖中华鳖（P<0.05），温室养殖中华鳖表现出较高的AKP、ACP活性；强制休眠后的仿生态养殖中华鳖血清SOD、LZM活性极显著高于温室养殖中华鳖（P<0.01）；水体中致病性嗜水气单胞菌胁迫下，两种模式养殖的中华鳖血清SOD、LZM活性差异不显著（P>0.05）。结果表明，仿生态养殖中华鳖具有较温室养殖中华鳖更高的抗病能力。
关键词：中华鳖； 嗜水气单胞菌； 强制休眠； 非特异性免疫
中华鳖（Pelodiscus sinensis Wiegmann） 属爬行纲、龟鳖目、鳖科，为我国淡水养殖的重要经济种类[1]。中华鳖养殖模式主要有温室养殖、池塘养殖和生态养殖，但一些人工养殖的鳖肉质粗糙、营养品质下降[2]，且病害日趋严重，可能是养殖模式的差异为中华鳖生存生长提供了不同的环境条件，环境条件的差异直接影响中华鳖的免疫应答[3-4]。本实验通过极端环境条件（强制休眠复苏和嗜水气单胞菌暴露）对中华鳖血清总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）活性影响的研究，探讨养殖模式对中华鳖抗逆性免疫应答的影响，为中华鳖健康养殖提供基础数据和技术支持。
1材料和方法
1.1实验动物与致病菌
仿生态养殖中华鳖和温室养殖中华鳖均购自水产市场，产地青岛。仿生态养殖中华鳖体色土黄、体质健壮、无外伤、平均体质量502±49 g，共计21只；温室养殖中华鳖体色灰黑、体制健壮、无外伤、平均体质量516±54 g，共计21只。
实验用致病性嗜水气单胞菌由山东省淡水渔业研究院疫病防控研究室提供，分离自染病鲤鱼。
1.2实验设计
1.2.1强制低温休眠实验选择平均体质量516±54 g的温室养殖中华鳖9只和平均体质量502±49 g仿生态养殖中华鳖9只，置4 ℃保鲜冰箱中强制休眠48 h后，取出放置室温（24 ℃）自然恢复其生理机能至正常活动（约2 h）。断头取血，4 ℃静置12 h使血液凝固析出血清（不加抗凝剂），3 000 r/min离心10 min分离血清，置-20 ℃冷冻保存，测定血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性。
1.2.2致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫实验选择平均体质量516±54 g的温室养殖中华鳖12只和平均体质量502±49 g仿生态养殖中华鳖12只，参考宋理平等[5]方法，进行致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫实验。将温室养殖和仿生态养殖中华鳖1∶1放入3个PVC周转箱（120 cm×80 cm×60 cm，水体100 L），每箱2种中华鳖各4只，在每箱水体中加入10 mL浓度108 CFU/mL的致病性嗜水气单胞菌，每天维持水体致病菌浓度，养殖7 d后，断头取血，4 ℃静置12 h让血液凝固析出血清（不加抗凝剂），3 000 r/min离心10 min分离血清，置-20 ℃冷冻保存，测定血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性。
1.3指标测定
血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性均为送样至南京建成生物工程研究所，使用相应试剂盒检测。
1.4数据处理和统计分析
实验结果用“平均值±标准差”表示，采用SPSS17.0软件对数据进行单因素方差分析和LSD多重比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2结果与分析
2.1强制低温休眠恢复时两种养殖模式中华鳖血清非特异性免疫的对比研究
表1数据显示，两种养殖模式下的中华鳖从低温休眠状态恢复直正常活动时的血清非特异性免疫能力具有显著差异，仿生态养殖中华鳖血清T-AOC活性显著高于温室养殖中华鳖（P<005），且SOD、LZM活性极显著高于温室养殖中华鳖（P<0.01）；温室养殖的中华鳖血清AKP活性极显著高于仿生态养殖（P<0.01），ACP活性显著高于仿生态养殖中华鳖（P<0.05）。
2.2嗜水气单胞菌暴露胁迫对中华鳖致病性的影响
如表2所示，水体致病性嗜水气单胞菌胁迫条件下部分仿生态中华鳖背腹部和四肢有少量溃疡病灶，而温室养殖中华鳖背腹部和四肢溃疡灶较多并有一只死亡。
2.3致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫对中华鳖血清非特异性免疫的影响
表3数据显示，水体中致病性嗜水气单胞菌胁迫下仿生态中华鳖血清T-AOC活性极显著高于温室养殖中华鳖（P<0.01）；两种养殖方式对中华鳖血清SOD、LZM活性无显著影响（P>0.05）；温室养殖中华鳖表现出较高的AKP、ACP活性，其中AKP活性极显著高于仿生态养殖组（P<0.01）， ACP活性显著高于仿生态养殖组（P<0.05）。
3讨论
机体非特异性免疫体系发挥作用的最直观体现就是抗病能力。嗜水气单胞菌是中华鳖的主要致病菌，在已报道的25种中华鳖疾病中有15种是由嗜水气单胞菌引起的，如红脖子病、腮腺炎病、红底板病、白底板病、腐皮病、疖疮病、穿孔病、烂甲病等[6]。本实验中在应对7 d的致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫时，2种养殖中华鳖表现出了不同的抗病能力，仿生态中华鳖背腹部和四肢有少量溃疡病灶，而温室养殖中华鳖背腹部和四肢溃疡灶较多并有一只死亡。从形体上看温室养殖中华鳖背甲较仿生态养殖鳖更凸起，已有畸形的迹象。实验中温室养殖中华鳖血清AKP、ACP活性较高，可能就是由于温室养殖过程中长期的环境胁迫导致骨骼、肝脏、脾脏等已产生病理变化导致。
LZM是吞噬细胞对所吞噬的病原菌能否杀灭的物质基础[7]，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，在受到外来抗原性物质刺激后LZM的活性通常会上升[8]。饲料中添加适量的半胱氨[9]、多糖[10-11]、益生菌[12]等均能提高中华鳖的LZM活性，增强其机体防御能力。SOD是对机体的氧化与抗氧化平衡起到至关重要的作用，能清除超氧阴离子自由基（O2-·），保护细胞免受损伤，从而提高机体的抗氧化功能和防病抗病能力。半胱氨[9]、乳酸菌[12]、绿原酸[13]等免疫增强剂可通过提高抗氧化酶活性来抑制脂质过氧化作用，从而增强中华鳖机体的抗氧化能力。本实验中，中华鳖低温休眠恢复时身体的各项机能相对较弱，仿生态养殖的中华鳖表现出極显著提高的LZM、SOD活性，可有效抵御细菌、活性氧和过氧化物等的侵袭，在机体非特异性免疫体系的恢复中发挥重要作用。 T-AOC的強弱与健康程度存在着密切联系，T-AOC体系各成份之间相互协同、代偿、依赖，主要通过三条途径形成机体的防御体系：（1）消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；（2）分解过氧化物，阻断过氧化链；（3）除去起催化作用的金属离子。T-AOC更加综合反映了机体非酶抗氧化系统和抗氧化酶系统共同的抗氧化作用。本实验中，中华鳖在强制低温休眠恢复期的免疫应答中，仿生态养殖中华鳖T-AOC活性显著高于温室养殖；在致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫时的免疫应答中，仿生态养殖中华鳖T-AOC体系的保护作用更加显著。因此，仿生态养殖中华鳖具有较温室养殖中华鳖更高的抗氧化能力，可有效降低养殖过程中病害的危害。
参考文献：
[1]
王道尊，汤峥嵘，谭玉钧.中华鳖生化组成的分析I.一般营养成分的含量及肌肉脂肪酸的组成[J].水生生物学报，1998，21（4）：299-305
[2] 王璐明，马晓，王晓清，等.不同养殖模式对中华鳖营养品质的影响[J].南方农业学报，2013，44（9）：1571-1575
[3] 蒋国民.水质对中华鳖养殖的主要影响[J].广西水产科技，2015（1）：42-45
[4] 李文艳，孙霞.环境因子对温室养殖中华鳖嗜水气单胞菌病发生的影响[J].科技信息， 2011（5）：128
[5] 宋理平，胡斌，王爱英，等.抗菌肽对凡纳滨对虾生长和机体免疫的影响[J].广东海洋大学学报，2010，30（3）：28-30
[6] 郑杰夫，张一柳，钟蕾.中华鳖源嗜水气单胞菌的研究进展[J].水产科学，2016，35（2）：191-198
[7] Anderson D P，Siwicki A K.Duration of Protection against Aeromonas salmonicida in Brook Trout Immunostimulated with Glucan or Chitosan by Injection or Immersion[J].Progressive Fish Culturist，1994，56（4）：258-261
[8] 陈昌福，罗宇良，蔡冰.饲养水温对草鱼溶菌酶活性的影响[J].中国水产科学，1996，3（3）：24-30
[9] 赵燕，代 兵，李传普，等.半胱胺对中华鳖生长性能和非特异性免疫功能的影响研究[J].动物营养学报，2007，19（3）：305-310
[10] 覃川杰，汪成竹，陈晓辉，等.茯苓多糖对中华鳖非特异性免疫功能的免疫调节作用[J].淡水渔业，2006，36（6）：40-43
[11] 汪成竹，姚鹃，吴凡，等.免疫多糖（酵母细胞壁）对中华鳖非特异性免疫功能的影响[J].华中农业大学学报，2006，25（4）：421-425
[12] 桂 琳，王晓清，康银，等.复合益生菌对中华鳖生长及血液生化指标的影响[J].水生态学杂志，2015，36（2）：95-100
[13] 温安祥，舒辉，肖洋.绿原酸对中华鳖生产性能及抗氧化能力的影响[J].动物营养学报，2010，22（3）：729-733
（收稿日期：2016-10-27）
关键词：中华鳖； 嗜水气单胞菌； 强制休眠； 非特异性免疫
中华鳖（Pelodiscus sinensis Wiegmann） 属爬行纲、龟鳖目、鳖科，为我国淡水养殖的重要经济种类[1]。中华鳖养殖模式主要有温室养殖、池塘养殖和生态养殖，但一些人工养殖的鳖肉质粗糙、营养品质下降[2]，且病害日趋严重，可能是养殖模式的差异为中华鳖生存生长提供了不同的环境条件，环境条件的差异直接影响中华鳖的免疫应答[3-4]。本实验通过极端环境条件（强制休眠复苏和嗜水气单胞菌暴露）对中华鳖血清总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）活性影响的研究，探讨养殖模式对中华鳖抗逆性免疫应答的影响，为中华鳖健康养殖提供基础数据和技术支持。
1材料和方法
1.1实验动物与致病菌
仿生态养殖中华鳖和温室养殖中华鳖均购自水产市场，产地青岛。仿生态养殖中华鳖体色土黄、体质健壮、无外伤、平均体质量502±49 g，共计21只；温室养殖中华鳖体色灰黑、体制健壮、无外伤、平均体质量516±54 g，共计21只。
实验用致病性嗜水气单胞菌由山东省淡水渔业研究院疫病防控研究室提供，分离自染病鲤鱼。
1.2实验设计
1.2.1强制低温休眠实验选择平均体质量516±54 g的温室养殖中华鳖9只和平均体质量502±49 g仿生态养殖中华鳖9只，置4 ℃保鲜冰箱中强制休眠48 h后，取出放置室温（24 ℃）自然恢复其生理机能至正常活动（约2 h）。断头取血，4 ℃静置12 h使血液凝固析出血清（不加抗凝剂），3 000 r/min离心10 min分离血清，置-20 ℃冷冻保存，测定血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性。
1.2.2致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫实验选择平均体质量516±54 g的温室养殖中华鳖12只和平均体质量502±49 g仿生态养殖中华鳖12只，参考宋理平等[5]方法，进行致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫实验。将温室养殖和仿生态养殖中华鳖1∶1放入3个PVC周转箱（120 cm×80 cm×60 cm，水体100 L），每箱2种中华鳖各4只，在每箱水体中加入10 mL浓度108 CFU/mL的致病性嗜水气单胞菌，每天维持水体致病菌浓度，养殖7 d后，断头取血，4 ℃静置12 h让血液凝固析出血清（不加抗凝剂），3 000 r/min离心10 min分离血清，置-20 ℃冷冻保存，测定血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性。
1.3指标测定
血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性均为送样至南京建成生物工程研究所，使用相应试剂盒检测。
1.4数据处理和统计分析
实验结果用“平均值±标准差”表示，采用SPSS17.0软件对数据进行单因素方差分析和LSD多重比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2结果与分析
2.1强制低温休眠恢复时两种养殖模式中华鳖血清非特异性免疫的对比研究
表1数据显示，两种养殖模式下的中华鳖从低温休眠状态恢复直正常活动时的血清非特异性免疫能力具有显著差异，仿生态养殖中华鳖血清T-AOC活性显著高于温室养殖中华鳖（P<005），且SOD、LZM活性极显著高于温室养殖中华鳖（P<0.01）；温室养殖的中华鳖血清AKP活性极显著高于仿生态养殖（P<0.01），ACP活性显著高于仿生态养殖中华鳖（P<0.05）。
2.2嗜水气单胞菌暴露胁迫对中华鳖致病性的影响
如表2所示，水体致病性嗜水气单胞菌胁迫条件下部分仿生态中华鳖背腹部和四肢有少量溃疡病灶，而温室养殖中华鳖背腹部和四肢溃疡灶较多并有一只死亡。
2.3致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫对中华鳖血清非特异性免疫的影响
表3数据显示，水体中致病性嗜水气单胞菌胁迫下仿生态中华鳖血清T-AOC活性极显著高于温室养殖中华鳖（P<0.01）；两种养殖方式对中华鳖血清SOD、LZM活性无显著影响（P>0.05）；温室养殖中华鳖表现出较高的AKP、ACP活性，其中AKP活性极显著高于仿生态养殖组（P<0.01）， ACP活性显著高于仿生态养殖组（P<0.05）。
3讨论
机体非特异性免疫体系发挥作用的最直观体现就是抗病能力。嗜水气单胞菌是中华鳖的主要致病菌，在已报道的25种中华鳖疾病中有15种是由嗜水气单胞菌引起的，如红脖子病、腮腺炎病、红底板病、白底板病、腐皮病、疖疮病、穿孔病、烂甲病等[6]。本实验中在应对7 d的致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫时，2种养殖中华鳖表现出了不同的抗病能力，仿生态中华鳖背腹部和四肢有少量溃疡病灶，而温室养殖中华鳖背腹部和四肢溃疡灶较多并有一只死亡。从形体上看温室养殖中华鳖背甲较仿生态养殖鳖更凸起，已有畸形的迹象。实验中温室养殖中华鳖血清AKP、ACP活性较高，可能就是由于温室养殖过程中长期的环境胁迫导致骨骼、肝脏、脾脏等已产生病理变化导致。
LZM是吞噬细胞对所吞噬的病原菌能否杀灭的物质基础[7]，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，在受到外来抗原性物质刺激后LZM的活性通常会上升[8]。饲料中添加适量的半胱氨[9]、多糖[10-11]、益生菌[12]等均能提高中华鳖的LZM活性，增强其机体防御能力。SOD是对机体的氧化与抗氧化平衡起到至关重要的作用，能清除超氧阴离子自由基（O2-·），保护细胞免受损伤，从而提高机体的抗氧化功能和防病抗病能力。半胱氨[9]、乳酸菌[12]、绿原酸[13]等免疫增强剂可通过提高抗氧化酶活性来抑制脂质过氧化作用，从而增强中华鳖机体的抗氧化能力。本实验中，中华鳖低温休眠恢复时身体的各项机能相对较弱，仿生态养殖的中华鳖表现出極显著提高的LZM、SOD活性，可有效抵御细菌、活性氧和过氧化物等的侵袭，在机体非特异性免疫体系的恢复中发挥重要作用。 T-AOC的強弱与健康程度存在着密切联系，T-AOC体系各成份之间相互协同、代偿、依赖，主要通过三条途径形成机体的防御体系：（1）消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；（2）分解过氧化物，阻断过氧化链；（3）除去起催化作用的金属离子。T-AOC更加综合反映了机体非酶抗氧化系统和抗氧化酶系统共同的抗氧化作用。本实验中，中华鳖在强制低温休眠恢复期的免疫应答中，仿生态养殖中华鳖T-AOC活性显著高于温室养殖；在致病性嗜水气单胞菌暴露胁迫时的免疫应答中，仿生态养殖中华鳖T-AOC体系的保护作用更加显著。因此，仿生态养殖中华鳖具有较温室养殖中华鳖更高的抗氧化能力，可有效降低养殖过程中病害的危害。
参考文献：
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王道尊，汤峥嵘，谭玉钧.中华鳖生化组成的分析I.一般营养成分的含量及肌肉脂肪酸的组成[J].水生生物学报，1998，21（4）：299-305
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[4] 李文艳，孙霞.环境因子对温室养殖中华鳖嗜水气单胞菌病发生的影响[J].科技信息， 2011（5）：128
[5] 宋理平，胡斌，王爱英，等.抗菌肽对凡纳滨对虾生长和机体免疫的影响[J].广东海洋大学学报，2010，30（3）：28-30
[6] 郑杰夫，张一柳，钟蕾.中华鳖源嗜水气单胞菌的研究进展[J].水产科学，2016，35（2）：191-198
[7] Anderson D P，Siwicki A K.Duration of Protection against Aeromonas salmonicida in Brook Trout Immunostimulated with Glucan or Chitosan by Injection or Immersion[J].Progressive Fish Culturist，1994，56（4）：258-261
[8] 陈昌福，罗宇良，蔡冰.饲养水温对草鱼溶菌酶活性的影响[J].中国水产科学，1996，3（3）：24-30
[9] 赵燕，代 兵，李传普，等.半胱胺对中华鳖生长性能和非特异性免疫功能的影响研究[J].动物营养学报，2007，19（3）：305-310
[10] 覃川杰，汪成竹，陈晓辉，等.茯苓多糖对中华鳖非特异性免疫功能的免疫调节作用[J].淡水渔业，2006，36（6）：40-43
[11] 汪成竹，姚鹃，吴凡，等.免疫多糖（酵母细胞壁）对中华鳖非特异性免疫功能的影响[J].华中农业大学学报，2006，25（4）：421-425
[12] 桂 琳，王晓清，康银，等.复合益生菌对中华鳖生长及血液生化指标的影响[J].水生态学杂志，2015，36（2）：95-100
[13] 温安祥，舒辉，肖洋.绿原酸对中华鳖生产性能及抗氧化能力的影响[J].动物营养学报，2010，22（3）：729-733
（收稿日期：2016-10-27）