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[摘要]目的：研究miR-198对慢性创面形成的影响，探讨miR-198靶向调控表皮干细胞内成纤维细胞生长因子受体1 （FGFR1）表达的可能机制与相关性。方法：所有大鼠以表皮干细胞培养划分为三组，对照组20只，采用基础饲料，40只复制糖尿病模型大鼠组，共32只建糖尿病大鼠慢性创面模型成功，其中16只为慢性创面组，另外16只通过快速尾静脉注射miR-198抑制剂转染系统溶液，命名为转染抑制载體组，通过免疫组织化学检测表皮干细胞表达，计算慢性创面的愈合率。通过细胞生长曲线测试和细胞周期分析miR-198对表皮干细胞的影响，实时定量PCR检测各组表皮干细胞中FGFR1表达。用Western-blot法检测各组细胞中FGFR1及下游Ras和MAPK蛋白的表达。结果：与对照组比较，慢性创面组miR-198表达量明显增高（P<0.01），转染抑制载体miR-198后，表皮干细胞中表达显著性下调（P<0.01），细胞周期分析发现慢性创面组会抑制表皮干细胞增殖，转染抑制载体（Anti-miR-198）阻断miR-198后表皮干细胞增殖得到恢复。免疫组化检测显示，慢性创面培养组FGFR1阳性表达数量增加，随着转染抑制miR-198载体的影响，FGFR1在转染抑制载体组表达增加更明显（P<0.01）。Western blot检测显示，在慢性创面模型中，转染抑制载体（Anti-miR-198）后，FGFR1的蛋白表达明显增加，转染抑制载体组Ras和MAPK的蛋白表达明显降低。结论：miR-198可能负向调控表皮干细胞FGFR1，抑制miR-198可以增强表皮干细胞FGFR1表达，加快表皮干细胞增殖和分化，从而能促进慢性创面愈合。
[关键词]miRNA-198;慢性创面;成纤维细胞生长因子受体1;表皮干细胞;愈合;修复
[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2019）05-0076-05
The Study of miRNA-198 Targeted Regulation of FGFR1 Expression in Epidermal Stem Cells to Induce the Mechanism of Chronic Wound
FENG Huan1，LIU Shi-yong2，ZHOU Yan3，KANG Hua-li4，HUANG Xiao-bing3
[the Second Affiliated Hospital of Army Medical University（Third Military Medical University）1.Wound Treatment Room;
2.Neurosurgery;3.Hepatobiliary Surgery;4.Laboratory，Chongqing 400037，China]
Abstract： Objective To investigate the effect of microRNA-198 （miR-198） on chronic wound formation， and the potential regulation mechanism of miR-198 via targeting fibroblast growth factor receptor 1 （FGFR1） in epidermal stem cells. Methods Sixty rats were included and divided into three groups according to the cultured epidermal stem cells. Twenty rats fed with basic diet were set into the control group. The others were in the diabetic model group， and of which， 32 rats were successfully established as the chronic wounds models. Next， these 32 rats were divided into chronic wound group （n=16） and transfection inhibitor vector group （n=16， this model were established by rapidly injecting miR-198 inhibitor transfection system solution via tail vein）. In order to calculate the healing rate of chronic wounds， the expression of epidermal stem cells was detected by immunohistochemistry. In addition， the effect of miR-198 on epidermal stem cells was further analyzed by cell growth curve test and cell cycle analysis， and the expression of fibroblast growth factor receptor-1 （FGFR1） in epidermal stem cells was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （PCR） test. Besides， the Western-blot method was used to detect the FGFR1 expression， and the corresponding downstream Ras and mitogen-activated protein kinase （MAPK） proteins were also detected. Results By comparing with control group， the miR-198 expression in the chronic wound group increased significantly （P<0.01）， and the expression of epidermal stem cells was significantly decreased in transfection inhibitor vector group （P<0.01）. In addition， cell cycle analysis showed that the proliferation of epidermal stem cells was inhibited in chronic wound group， which can be repaired after blocking miRNA-198 proliferation by transfection inhibition vector （Anti-miR-198）. Immunohistochemical results showed that the FGFR1 expression increased in the chronic wound group， and increased more significantly in the transfection inhibition vector group （P<0.01） underlying the influence of the transfection inhibition vector of miR-198. Western blot analysis showed that in the transfection inhibition vector group， FGFR1 increased significantly， and Ras and MAPK decreased significantly. Conclusions miR-198 may negatively regulate epidermal stem cell FGFR1. Inhibition of miR-198 can enhance the expression of FGFR1 in epidermal stem cells， accelerate the proliferation and differentiation of epidermal stem cells， and thus promote the healing of chronic wounds. Key words： miRNA-198; chronic wound; fibroblast growth factor receptor 1; epidermal stem cells; heal; repair
慢性创面的治疗是老年化社会面临的医学难题之一。文献表明[1]，全球每年有超過150万的住院患者会出现糖尿病足溃疡或压疮等慢性创面，加大患者感染等并发症发生的可能，也给患者和社会带来沉重的经济和医疗负担。因此，研究其机制具有重要的科学和现实意义。既往研究发现，炎症反应异常可能是造成慢性创面愈合修复延迟的重要原因，而各种细胞因子和生长因子，局部组织干细胞和循环来源的干细胞均参与了这一过程。miRNA在创面愈合中发挥重要的调控作用：Wang等研究发现，在创面愈合过程中miR-21可调控表皮层的上皮细胞和真皮间充质细胞的活化和迁移[2];Xu等发现在糖尿病患者慢性创面中miR-146a可能调控炎症反应途径，参与调节间充质干细胞，从而促进创面愈合[3]。此外，miRNA尚可通过调控干细胞自我更新、定向分化等过程影响创面愈合[4-5]。笔者研究也发现，慢性创面环境中存在miR-198异常高的表达，可能造成了创面难愈合现象。因此，研究miR-198对慢性创面中表皮干细胞增殖和分化产生影响的作用机制，将有望阐明慢性创面发病机制，也为寻找新的治疗靶点提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物：3月龄雄性普通级Wistar大鼠60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重200～250g，实验前测定基础血糖与尿糖。
1.2 试剂：四氧嘧啶（上海鼓臣生物公司，批号：GC8748）、中性蛋白酶（北京索莱宝公司，批号：Z8030）、胰蛋白酶（北京瑞达恒辉科技发展有限公司，批号：HB-0103-01）、β1-integrin和角质蛋白K19试剂盒（美国赛默飞世尔科技，批号：4366594和4798695）、FGFR1抗体（美国赛默飞世尔科技，批号：822255）、Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（上海前尘生物科技有限公司，批号：40302ES20）、小牛血清（北京索莱宝公司，批号：01-045），RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司，批号：11875-093）等。
1.3 方法
1.3.1 造模及分组：60只雄性普通级Wistar大鼠，在进行适应性喂养1周后，取20只用基础饲料喂养，其余40只造模组按体重150mg/kg腹腔注射3%四氧嘧啶，1周后当动物血糖浓度大于11?mmol/l即为糖尿病模型复制成功。创面模型制作取上述60只大鼠，麻醉后在无菌条件下用打孔器在鼠背中部脊柱两侧各打一圆孔，深至皮下，直径1.8cm，创面面积为2.54cm2。止血后包扎，确定创面造模成功，其中40只糖尿病大鼠共有32只造模成功，其中16只命名为慢性创面组，另外16只在创面组织处运用脂质体Lipofectamine 2 000转染试剂进行转染，根据鼠源pGC-FU-anti-miR198序列，设计并合成其双链模拟物，转染FAM标记pGC-FU-anti-miR198模拟物（n=5）。转染72h后在倒置荧光显微镜下观察转染情况，命名为转染抑制载体组，制作后定时测血糖，采用补充注射四氧嘧啶或胰岛素（2?/只）方式维持糖尿病动物血糖在11～16.5mmol/l，其余20只非糖尿病大鼠命名为对照组，隔天观察创面变化，用透明膜描记和照像法记录创面大小，计算机图象分析系统进行处理、校定，计算创面愈合。
1.3.2 miR-198对慢性创面愈合的影响：在确定anti-miR198载体转染慢性创面动物模型构建好之后，观察3、5、7、10、14d各组创面的变化，计算创面愈合率，动物致伤后立即测定面积为伤口原始面积，愈合指数=（1-现创面面积/原创面面积）×100%。
1.3.3 创面表皮干细胞的体外培养：取正常组、慢性创面组和转染抑制载体组72h后的大鼠创面处皮肤，标本用0.01M PBS和青/链霉素双抗液反复冲洗5次，彻底清除血污。无菌条件下用眼科剪修剪标本，去除皮下软组织，将标本剪成约0.3cm×0.5cm皮肤碎片。将皮肤碎片浸入0.25% DispaseⅡ溶液，4℃，静置12～16h后取出皮片，弃去0.25% Dispase Ⅱ溶液，在培养皿中用0.01M PBS反复冲洗3次，用眼科镊分离表皮与真皮，收集表皮组织，将表皮组织浸入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化15min左右后加入适量含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化。用200目滤网过滤得到的混悬液，收集滤液，1 000rpm/min离心5min。弃上清，0.01M PBS重悬细胞，PBS重悬洗涤的细胞1 000rpm/min离心5min。弃上清，加入DK-SFM培养基，制成悬液，将细胞接种于包被好Ⅳ型胶原的细胞培养瓶中，37℃、5% CO2细胞培养箱中静置10min。小心弃去细胞培养瓶中的液体，用PBS轻轻漂洗后，加入DK-SFM培养基。镜下观察，培养瓶底部有贴壁的小圆形细胞，即为分离培养的原代大鼠ESCs。置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。第2天更换细胞培养基，以后每2d更换一次培养基。采用克隆形成率和生长曲线方法测试干细胞的增殖情况，同时免疫组化方法检测β1-integrin和角质蛋白K19的表达，鉴定其为表皮干细胞。
1.3.4 RT-PCR检测各组大鼠创面表皮干细胞miR-198表达：取对照组、慢性创面组及转染抑制载体组72h后的创面表皮干细胞，采用Trizol一步法对各组大鼠创面表皮干细胞RNA进行提取，利用分光光度法检测总RNA的浓度，甲醛变性胶电泳质检总RNA的质量，使用mirVanaTM miRNA纯化试剂盒对总RNA进行纯化，纯化后重新定量，miRNA-198的mRNA表达检测：每个样本各取2μg总RNA，采用互补DNA反转录试剂盒合成总互补DNA，反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和荧光定量RT-PCR仪行PCR，PCR反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。每个样本重复PCR反应3次。采用Δ循环阈值（Ct）法处理结果，计算相对表达量2-ΔΔCt。 1.3.5 miR-198对创面表皮干细胞生长周期的影响：在培养基中，取第2代表皮干细胞，以1.3×104cells/cm2的密度接种于六孔板中，接种后12h，胰酶消化六孔内细胞，制成单细胞悬液。细胞生长达到60%～70%融合时，0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，加小鼠抗大鼠α6-integrin单克隆抗体，室温孵育30min，Buffer缓冲液洗涤2遍。加抗小鼠PE，室温避光15min，Buffer缓冲液洗涤2遍，流式细胞仪检测，观察miR-198高表达和抑制miR-198后对慢性创面表皮干细胞生长周期的影响。
1.3.6 miR-198调控创面表皮干细胞的作用靶点分析
1.3.6.1 SP法检测创面表皮干细胞FGFR1及其下游Ras和MAPK的阳性表达变化情况：各实验动物选取一张切片，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法，将样本依次采用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水处理，滴加双氧水后进行抗原修复，依次加入一抗、二抗进行孵育，并严格按照说明书操作，最后DAB/双氧水显色后，再用苏木精复染，常规脱水、透明封片后进行观察。每组随机取5个视野，重复6次，每片于200倍镜下读取阳性细胞数，取平均值，用PBS代替一抗作阴性对照。在无背景着色的情况下，以细胞内出现黄色颗粒为阳性，对染色强度和阳性细胞数进行综合考虑。
1.3.6.2 Western blot法检测各组创面表皮干细胞FGFR1及其下游Ras和MAPK蛋白的变化：表皮干细胞经过研磨、裂解后，通过酶标仪测定蛋白浓度。上样总蛋白质量为80μg，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，将蛋白质通过电印迹转移法转至PVDF膜，采用丽春红S染色，并根据所需要的目标条带进行剪膜。用含有脱脂奶粉（质量浓度为5%）的TBS-T溶液在室温下封闭2h，分别加入I抗（FGFR1抗工作液浓度为1：2 000，Ras和MAPK抗工作液浓度为1：300，GAPDH I抗工作液浓度为1：500），4℃过夜。TTBS洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或小鼠II抗（1：18 000稀释），用TBS-T溶液洗膜后与ECL试剂进行反应，胶片曝光，扫描胶片，用Image J软件计算条带光密度（OD）值，以GAPDH为内参进行系统软件分析条带的OD比值，评定蛋白质的表达水平。
1.4 统计学分析：采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，实验结果以均数±标准差（x?±s）表示，重复测量数据比较采用多元方差分析方法，组间两两比较采用t检验，P<0.05、P<0.01表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-198对创面愈合的影响：与对照组比较，在第3、5、7、10、14天，慢性创面组的创面愈合率明显低于对照组（P<0.01），與慢性创面组比较，转染抑制载体组在第3、5、7、10、14天的创面愈合率明显高于慢性创面组 （P<0.05，P<0.01），见表1。
2.2 表皮干细胞的分离培养和鉴定：采用血清角质形成细胞培养基KSFM（Gibco），添加表皮细胞生长因子和牛垂体提取物培养。发现其能在体外扩增，长期传代培养，具有自我更新和多分化潜能。同时，笔者采用免疫组化方法证实了β1-integrin在培养细胞中的表达，诱导分化后表达角质蛋白K19，鉴定其为表皮干细胞，见图1。
2.3 各组创面表皮干细胞中miR-198表达的检测：研究结果显示，与对照组比较，慢性创面组的miR-198表达量明显增高（P<0.01），而在转染抑制载体组中，表皮干细胞中的miR-198表达显著性下调（P<0.01），见图2。
2.4 miR-198对表皮干细胞增殖的影响：采用细胞周期分析发现，慢性创面组抑制了表皮干细胞的增殖，而转染抑制载体（Anti-miR-198）阻断miR-198后表皮干细胞的增殖得到恢复，提示miR-198可能作用于慢性创面表皮干细胞而发挥其抑制作用，见图3。
2.5 miR-198对创面表皮干细胞FGFR1的影响：免疫组化检测显示，与对照组比较，慢性创面培养组的创面表皮干细胞FGFR1阳性表达数量减少，随着转染抑制miR-198载体的影响，创面表皮干细胞FGFR1在转染抑制载体组的表达增加明显。见图4。
2.6 免疫组织化学检测各组表皮干细胞中FGFR1及其下游Ras和MAPK的表达：与对照组相比，慢性创面组表皮干细胞中的FGFR1的表达明显降低（P<0.01），Ras和MAPK的表达明显增加;与慢性创面组比较，转染抑制miR-198载体后，表皮干细胞中FGFR1的表达明显增加（P<0.01），Ras和MAPK的表达均明显下降（P<0.01），见表2。
2.7 miR-198对创面表皮干细胞下游Ras和MAPK蛋白的影响：Western blot检测显示，在慢性创面模型中，转染抑制miR-198载体后，创面表皮干细胞中FGFR1的蛋白表达明显增加，初步提示FGFR1可能是miR-198作用于表皮干细胞的靶点，在慢性创面组中，表皮干细胞中Ras和MAPK的蛋白表达明显高于对照组和转染抑制载体组，见图5。
3 讨论
创面愈合是一个复杂的生物学过程[6]：可以分为炎症反应，肉芽组织形成、再上皮化及创面闭合后的塑形三个阶段。创伤的愈合过程是在炎症反应启动下，趋化干细胞和相应效应细胞到达受伤部位，在各种细胞因子、生长因子协同作用下，干细胞和相关细胞转化修复。已经证实[4-5]，在创面愈合过程中miRNA可通过干扰皮肤形态形成，抑制炎性细胞的粘附，调节免疫细胞的功能，影响组织血管生成等环节，进而影响创面愈合。
已有研究显示，表皮干细胞等多种干细胞在创伤修复中发挥重要作用[7-9]，是影响创面肉芽形成和再上皮化的重要细胞，而上皮化延迟或停顿被认为是慢性创面形成的关键因素[10-11]。基于miRNA在慢性创面愈合中的重要作用，慢性创面组能够抑制表皮干细胞的增殖，而采用转染抑制载体（Anti-miR-198）阻断miR-198后表皮干细胞的增殖得到恢复，提示miR-198可能作用于慢性创面表皮干细胞而发挥其抑制作用。Koenen P等[12]也发现类似现象，急性创面分泌物促进干细胞增殖，采用慢性分泌物作用于干细胞后则抑制其增殖。Sundaram[13]发现正常愈合创面中上皮角化细胞低表达miR-198，而在糖尿病足溃疡等患者慢性创面中则为异常高表达。皮肤角化细胞转染miR-198后，发现其迁移、增殖分化的能力明显下降，再上皮化和愈合能力相应下降。本研究发现，在慢性创面组表皮干细胞中miR-198的相对表达量增加，表明miR-198是慢性创面形成的重要因素。 笔者采用生物信息学分析方法，运用Targetscan、miRanda、PicTar预测软件在Targetscan、miRDB等数据库中分析3 UTR结合位点以筛选出miR-198的作用靶点，结果显示包括成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）可能是其作用靶点，为此笔者采用免疫组化和Western blot方法检测了FGFR1基因在表皮干细胞（体外培养）中的表达，发现FGFR1的表达随着转染抑制载体的加入明显增加，而其下游的Ras和MAPK的蛋白表达明显降低，这更有利于慢性创面的愈合，初步提示FGFR1可能是miR-198作用于表皮干细胞的靶点。此外有研究发现[14]，FGFR1可使间充质干细胞转分化为成纤维细胞，这可能为创面愈合提供有效的组织细胞。笔者在研究中也发现，转染抑制载体组的创面愈合率明显增加，而在慢性创面组中，慢性创面愈合明显低于转染抑制载体组，因此miR-198作用于表皮干细胞FGFR1具有一定理论基础，即miR-198可能通过负相调控表皮干细胞FGFR1，抑制表皮干细胞的增殖和分化而影响慢性创面愈合。
[参考文献]
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[3]Xu J，Wu W，Zhang L，et al.The role of microRNA-146a in the pathogenesis of the diabetic wound-healing impairment：correction with mesenchymal stem cell treatment[J].Diabetes，2012，61（11）：2906-2912.
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[13]Sundaram GM，Common JE，Gopal FE，et al.'See-saw' expression of microRNA-198 and FSTL1 from a single transcript in wound healing[J].Nature，2013，495（7439）：103-106.
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[收稿日期]2018-10-11
本文引用格式：冯欢，刘仕勇，周燕，等.miRNA-198靶向调控表皮干细胞内FGFR1表达诱导慢性创面形成的机制研究[J].中国美容医学，2019，28（5）：76-80.
[关键词]miRNA-198;慢性创面;成纤维细胞生长因子受体1;表皮干细胞;愈合;修复
[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2019）05-0076-05
The Study of miRNA-198 Targeted Regulation of FGFR1 Expression in Epidermal Stem Cells to Induce the Mechanism of Chronic Wound
FENG Huan1，LIU Shi-yong2，ZHOU Yan3，KANG Hua-li4，HUANG Xiao-bing3
[the Second Affiliated Hospital of Army Medical University（Third Military Medical University）1.Wound Treatment Room;
2.Neurosurgery;3.Hepatobiliary Surgery;4.Laboratory，Chongqing 400037，China]
Abstract： Objective To investigate the effect of microRNA-198 （miR-198） on chronic wound formation， and the potential regulation mechanism of miR-198 via targeting fibroblast growth factor receptor 1 （FGFR1） in epidermal stem cells. Methods Sixty rats were included and divided into three groups according to the cultured epidermal stem cells. Twenty rats fed with basic diet were set into the control group. The others were in the diabetic model group， and of which， 32 rats were successfully established as the chronic wounds models. Next， these 32 rats were divided into chronic wound group （n=16） and transfection inhibitor vector group （n=16， this model were established by rapidly injecting miR-198 inhibitor transfection system solution via tail vein）. In order to calculate the healing rate of chronic wounds， the expression of epidermal stem cells was detected by immunohistochemistry. In addition， the effect of miR-198 on epidermal stem cells was further analyzed by cell growth curve test and cell cycle analysis， and the expression of fibroblast growth factor receptor-1 （FGFR1） in epidermal stem cells was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （PCR） test. Besides， the Western-blot method was used to detect the FGFR1 expression， and the corresponding downstream Ras and mitogen-activated protein kinase （MAPK） proteins were also detected. Results By comparing with control group， the miR-198 expression in the chronic wound group increased significantly （P<0.01）， and the expression of epidermal stem cells was significantly decreased in transfection inhibitor vector group （P<0.01）. In addition， cell cycle analysis showed that the proliferation of epidermal stem cells was inhibited in chronic wound group， which can be repaired after blocking miRNA-198 proliferation by transfection inhibition vector （Anti-miR-198）. Immunohistochemical results showed that the FGFR1 expression increased in the chronic wound group， and increased more significantly in the transfection inhibition vector group （P<0.01） underlying the influence of the transfection inhibition vector of miR-198. Western blot analysis showed that in the transfection inhibition vector group， FGFR1 increased significantly， and Ras and MAPK decreased significantly. Conclusions miR-198 may negatively regulate epidermal stem cell FGFR1. Inhibition of miR-198 can enhance the expression of FGFR1 in epidermal stem cells， accelerate the proliferation and differentiation of epidermal stem cells， and thus promote the healing of chronic wounds. Key words： miRNA-198; chronic wound; fibroblast growth factor receptor 1; epidermal stem cells; heal; repair
慢性创面的治疗是老年化社会面临的医学难题之一。文献表明[1]，全球每年有超過150万的住院患者会出现糖尿病足溃疡或压疮等慢性创面，加大患者感染等并发症发生的可能，也给患者和社会带来沉重的经济和医疗负担。因此，研究其机制具有重要的科学和现实意义。既往研究发现，炎症反应异常可能是造成慢性创面愈合修复延迟的重要原因，而各种细胞因子和生长因子，局部组织干细胞和循环来源的干细胞均参与了这一过程。miRNA在创面愈合中发挥重要的调控作用：Wang等研究发现，在创面愈合过程中miR-21可调控表皮层的上皮细胞和真皮间充质细胞的活化和迁移[2];Xu等发现在糖尿病患者慢性创面中miR-146a可能调控炎症反应途径，参与调节间充质干细胞，从而促进创面愈合[3]。此外，miRNA尚可通过调控干细胞自我更新、定向分化等过程影响创面愈合[4-5]。笔者研究也发现，慢性创面环境中存在miR-198异常高的表达，可能造成了创面难愈合现象。因此，研究miR-198对慢性创面中表皮干细胞增殖和分化产生影响的作用机制，将有望阐明慢性创面发病机制，也为寻找新的治疗靶点提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物：3月龄雄性普通级Wistar大鼠60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重200～250g，实验前测定基础血糖与尿糖。
1.2 试剂：四氧嘧啶（上海鼓臣生物公司，批号：GC8748）、中性蛋白酶（北京索莱宝公司，批号：Z8030）、胰蛋白酶（北京瑞达恒辉科技发展有限公司，批号：HB-0103-01）、β1-integrin和角质蛋白K19试剂盒（美国赛默飞世尔科技，批号：4366594和4798695）、FGFR1抗体（美国赛默飞世尔科技，批号：822255）、Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（上海前尘生物科技有限公司，批号：40302ES20）、小牛血清（北京索莱宝公司，批号：01-045），RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司，批号：11875-093）等。
1.3 方法
1.3.1 造模及分组：60只雄性普通级Wistar大鼠，在进行适应性喂养1周后，取20只用基础饲料喂养，其余40只造模组按体重150mg/kg腹腔注射3%四氧嘧啶，1周后当动物血糖浓度大于11?mmol/l即为糖尿病模型复制成功。创面模型制作取上述60只大鼠，麻醉后在无菌条件下用打孔器在鼠背中部脊柱两侧各打一圆孔，深至皮下，直径1.8cm，创面面积为2.54cm2。止血后包扎，确定创面造模成功，其中40只糖尿病大鼠共有32只造模成功，其中16只命名为慢性创面组，另外16只在创面组织处运用脂质体Lipofectamine 2 000转染试剂进行转染，根据鼠源pGC-FU-anti-miR198序列，设计并合成其双链模拟物，转染FAM标记pGC-FU-anti-miR198模拟物（n=5）。转染72h后在倒置荧光显微镜下观察转染情况，命名为转染抑制载体组，制作后定时测血糖，采用补充注射四氧嘧啶或胰岛素（2?/只）方式维持糖尿病动物血糖在11～16.5mmol/l，其余20只非糖尿病大鼠命名为对照组，隔天观察创面变化，用透明膜描记和照像法记录创面大小，计算机图象分析系统进行处理、校定，计算创面愈合。
1.3.2 miR-198对慢性创面愈合的影响：在确定anti-miR198载体转染慢性创面动物模型构建好之后，观察3、5、7、10、14d各组创面的变化，计算创面愈合率，动物致伤后立即测定面积为伤口原始面积，愈合指数=（1-现创面面积/原创面面积）×100%。
1.3.3 创面表皮干细胞的体外培养：取正常组、慢性创面组和转染抑制载体组72h后的大鼠创面处皮肤，标本用0.01M PBS和青/链霉素双抗液反复冲洗5次，彻底清除血污。无菌条件下用眼科剪修剪标本，去除皮下软组织，将标本剪成约0.3cm×0.5cm皮肤碎片。将皮肤碎片浸入0.25% DispaseⅡ溶液，4℃，静置12～16h后取出皮片，弃去0.25% Dispase Ⅱ溶液，在培养皿中用0.01M PBS反复冲洗3次，用眼科镊分离表皮与真皮，收集表皮组织，将表皮组织浸入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化15min左右后加入适量含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化。用200目滤网过滤得到的混悬液，收集滤液，1 000rpm/min离心5min。弃上清，0.01M PBS重悬细胞，PBS重悬洗涤的细胞1 000rpm/min离心5min。弃上清，加入DK-SFM培养基，制成悬液，将细胞接种于包被好Ⅳ型胶原的细胞培养瓶中，37℃、5% CO2细胞培养箱中静置10min。小心弃去细胞培养瓶中的液体，用PBS轻轻漂洗后，加入DK-SFM培养基。镜下观察，培养瓶底部有贴壁的小圆形细胞，即为分离培养的原代大鼠ESCs。置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。第2天更换细胞培养基，以后每2d更换一次培养基。采用克隆形成率和生长曲线方法测试干细胞的增殖情况，同时免疫组化方法检测β1-integrin和角质蛋白K19的表达，鉴定其为表皮干细胞。
1.3.4 RT-PCR检测各组大鼠创面表皮干细胞miR-198表达：取对照组、慢性创面组及转染抑制载体组72h后的创面表皮干细胞，采用Trizol一步法对各组大鼠创面表皮干细胞RNA进行提取，利用分光光度法检测总RNA的浓度，甲醛变性胶电泳质检总RNA的质量，使用mirVanaTM miRNA纯化试剂盒对总RNA进行纯化，纯化后重新定量，miRNA-198的mRNA表达检测：每个样本各取2μg总RNA，采用互补DNA反转录试剂盒合成总互补DNA，反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和荧光定量RT-PCR仪行PCR，PCR反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。每个样本重复PCR反应3次。采用Δ循环阈值（Ct）法处理结果，计算相对表达量2-ΔΔCt。 1.3.5 miR-198对创面表皮干细胞生长周期的影响：在培养基中，取第2代表皮干细胞，以1.3×104cells/cm2的密度接种于六孔板中，接种后12h，胰酶消化六孔内细胞，制成单细胞悬液。细胞生长达到60%～70%融合时，0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，加小鼠抗大鼠α6-integrin单克隆抗体，室温孵育30min，Buffer缓冲液洗涤2遍。加抗小鼠PE，室温避光15min，Buffer缓冲液洗涤2遍，流式细胞仪检测，观察miR-198高表达和抑制miR-198后对慢性创面表皮干细胞生长周期的影响。
1.3.6 miR-198调控创面表皮干细胞的作用靶点分析
1.3.6.1 SP法检测创面表皮干细胞FGFR1及其下游Ras和MAPK的阳性表达变化情况：各实验动物选取一张切片，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法，将样本依次采用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水处理，滴加双氧水后进行抗原修复，依次加入一抗、二抗进行孵育，并严格按照说明书操作，最后DAB/双氧水显色后，再用苏木精复染，常规脱水、透明封片后进行观察。每组随机取5个视野，重复6次，每片于200倍镜下读取阳性细胞数，取平均值，用PBS代替一抗作阴性对照。在无背景着色的情况下，以细胞内出现黄色颗粒为阳性，对染色强度和阳性细胞数进行综合考虑。
1.3.6.2 Western blot法检测各组创面表皮干细胞FGFR1及其下游Ras和MAPK蛋白的变化：表皮干细胞经过研磨、裂解后，通过酶标仪测定蛋白浓度。上样总蛋白质量为80μg，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，将蛋白质通过电印迹转移法转至PVDF膜，采用丽春红S染色，并根据所需要的目标条带进行剪膜。用含有脱脂奶粉（质量浓度为5%）的TBS-T溶液在室温下封闭2h，分别加入I抗（FGFR1抗工作液浓度为1：2 000，Ras和MAPK抗工作液浓度为1：300，GAPDH I抗工作液浓度为1：500），4℃过夜。TTBS洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或小鼠II抗（1：18 000稀释），用TBS-T溶液洗膜后与ECL试剂进行反应，胶片曝光，扫描胶片，用Image J软件计算条带光密度（OD）值，以GAPDH为内参进行系统软件分析条带的OD比值，评定蛋白质的表达水平。
1.4 统计学分析：采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，实验结果以均数±标准差（x?±s）表示，重复测量数据比较采用多元方差分析方法，组间两两比较采用t检验，P<0.05、P<0.01表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-198对创面愈合的影响：与对照组比较，在第3、5、7、10、14天，慢性创面组的创面愈合率明显低于对照组（P<0.01），與慢性创面组比较，转染抑制载体组在第3、5、7、10、14天的创面愈合率明显高于慢性创面组 （P<0.05，P<0.01），见表1。
2.2 表皮干细胞的分离培养和鉴定：采用血清角质形成细胞培养基KSFM（Gibco），添加表皮细胞生长因子和牛垂体提取物培养。发现其能在体外扩增，长期传代培养，具有自我更新和多分化潜能。同时，笔者采用免疫组化方法证实了β1-integrin在培养细胞中的表达，诱导分化后表达角质蛋白K19，鉴定其为表皮干细胞，见图1。
2.3 各组创面表皮干细胞中miR-198表达的检测：研究结果显示，与对照组比较，慢性创面组的miR-198表达量明显增高（P<0.01），而在转染抑制载体组中，表皮干细胞中的miR-198表达显著性下调（P<0.01），见图2。
2.4 miR-198对表皮干细胞增殖的影响：采用细胞周期分析发现，慢性创面组抑制了表皮干细胞的增殖，而转染抑制载体（Anti-miR-198）阻断miR-198后表皮干细胞的增殖得到恢复，提示miR-198可能作用于慢性创面表皮干细胞而发挥其抑制作用，见图3。
2.5 miR-198对创面表皮干细胞FGFR1的影响：免疫组化检测显示，与对照组比较，慢性创面培养组的创面表皮干细胞FGFR1阳性表达数量减少，随着转染抑制miR-198载体的影响，创面表皮干细胞FGFR1在转染抑制载体组的表达增加明显。见图4。
2.6 免疫组织化学检测各组表皮干细胞中FGFR1及其下游Ras和MAPK的表达：与对照组相比，慢性创面组表皮干细胞中的FGFR1的表达明显降低（P<0.01），Ras和MAPK的表达明显增加;与慢性创面组比较，转染抑制miR-198载体后，表皮干细胞中FGFR1的表达明显增加（P<0.01），Ras和MAPK的表达均明显下降（P<0.01），见表2。
2.7 miR-198对创面表皮干细胞下游Ras和MAPK蛋白的影响：Western blot检测显示，在慢性创面模型中，转染抑制miR-198载体后，创面表皮干细胞中FGFR1的蛋白表达明显增加，初步提示FGFR1可能是miR-198作用于表皮干细胞的靶点，在慢性创面组中，表皮干细胞中Ras和MAPK的蛋白表达明显高于对照组和转染抑制载体组，见图5。
3 讨论
创面愈合是一个复杂的生物学过程[6]：可以分为炎症反应，肉芽组织形成、再上皮化及创面闭合后的塑形三个阶段。创伤的愈合过程是在炎症反应启动下，趋化干细胞和相应效应细胞到达受伤部位，在各种细胞因子、生长因子协同作用下，干细胞和相关细胞转化修复。已经证实[4-5]，在创面愈合过程中miRNA可通过干扰皮肤形态形成，抑制炎性细胞的粘附，调节免疫细胞的功能，影响组织血管生成等环节，进而影响创面愈合。
已有研究显示，表皮干细胞等多种干细胞在创伤修复中发挥重要作用[7-9]，是影响创面肉芽形成和再上皮化的重要细胞，而上皮化延迟或停顿被认为是慢性创面形成的关键因素[10-11]。基于miRNA在慢性创面愈合中的重要作用，慢性创面组能够抑制表皮干细胞的增殖，而采用转染抑制载体（Anti-miR-198）阻断miR-198后表皮干细胞的增殖得到恢复，提示miR-198可能作用于慢性创面表皮干细胞而发挥其抑制作用。Koenen P等[12]也发现类似现象，急性创面分泌物促进干细胞增殖，采用慢性分泌物作用于干细胞后则抑制其增殖。Sundaram[13]发现正常愈合创面中上皮角化细胞低表达miR-198，而在糖尿病足溃疡等患者慢性创面中则为异常高表达。皮肤角化细胞转染miR-198后，发现其迁移、增殖分化的能力明显下降，再上皮化和愈合能力相应下降。本研究发现，在慢性创面组表皮干细胞中miR-198的相对表达量增加，表明miR-198是慢性创面形成的重要因素。 笔者采用生物信息学分析方法，运用Targetscan、miRanda、PicTar预测软件在Targetscan、miRDB等数据库中分析3 UTR结合位点以筛选出miR-198的作用靶点，结果显示包括成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）可能是其作用靶点，为此笔者采用免疫组化和Western blot方法检测了FGFR1基因在表皮干细胞（体外培养）中的表达，发现FGFR1的表达随着转染抑制载体的加入明显增加，而其下游的Ras和MAPK的蛋白表达明显降低，这更有利于慢性创面的愈合，初步提示FGFR1可能是miR-198作用于表皮干细胞的靶点。此外有研究发现[14]，FGFR1可使间充质干细胞转分化为成纤维细胞，这可能为创面愈合提供有效的组织细胞。笔者在研究中也发现，转染抑制载体组的创面愈合率明显增加，而在慢性创面组中，慢性创面愈合明显低于转染抑制载体组，因此miR-198作用于表皮干细胞FGFR1具有一定理论基础，即miR-198可能通过负相调控表皮干细胞FGFR1，抑制表皮干细胞的增殖和分化而影响慢性创面愈合。
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[收稿日期]2018-10-11
本文引用格式：冯欢，刘仕勇，周燕，等.miRNA-198靶向调控表皮干细胞内FGFR1表达诱导慢性创面形成的机制研究[J].中国美容医学，2019，28（5）：76-80.