【摘 要】
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目的 构建带Flag标签的长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)基因的真核表达载体,并对其表达产物Flag-ACSL4的生物学功能进行初步鉴
【机 构】
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贵州大学医学院,贵阳 550025;军事科学院军事医学研究院生物工程研究所,北京 100850;山西医科大学,太原030000;大连医科大学肿瘤干细胞研究院,辽宁大连 116044
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目的 构建带Flag标签的长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)基因的真核表达载体,并对其表达产物Flag-ACSL4的生物学功能进行初步鉴定.方法 通过PCR技术从人乳腺文库中扩增出ACSL4基因,并将其克隆到Flag载体中,经酶切和测序验证成功后,转染到乳腺癌ZR75-1细胞中,再通过Western印迹检测其表达情况,并通过细胞增殖检测、划痕、Transwell和铁死亡敏感性实验,测定细胞的增殖能力及ACSL4对乳腺癌细胞铁死亡的影响.结果 从人乳腺文库中扩增得到大小为2136 bp的DNA片段,成功克隆到Flag载体上,经测序与目的序列完全一致,转染乳腺癌ZR75-1细胞后基因表达成功.细胞增殖实验表明,与空载体细胞相比,转染Flag-ACSL4的乳腺癌细胞增殖较快.划痕实验显示,转染Flag-ACSL4的乳腺癌ZR75-1细胞较空载体细胞迁移性增强.Transwell实验显示,转染Flag-ACSL4的乳腺癌ZR75-1细胞较空载体细胞侵袭能力增强.铁死亡敏感性实验表明,ACSL4可使铁死亡诱导剂RSL3(Ras-selective-lethal compound 3)诱导的细胞死亡敏感性显著增强.结论 成功构建了带Flag标签的人ACSL4真核表达载体,为进一步研究ACSL4在脂肪酸代谢和在肿瘤发生发展中的功能打下良好的基础.
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