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摘 要：通过热水浸提法和醇沉法对木瓜果实的多糖进行提取，探讨热水提取温度、料液比、热水提取时间以及醇沉时乙醇浓度4个因素对木瓜果实多糖提取的影响，并以多糖含量为指标，蒽酮-硫酸比色法为测定方法，采用正交试验法确定木瓜果实多糖提取的最佳工艺条件。结果表明，提取温度80℃，料液比1：60g/mL，提取时间60min，乙醇浓度80%，在此条件下多糖的提取率达到5.6%，工艺条件最佳，具有可行性和可靠性。
关键词：木瓜；多糖提取；正交试验；蒽酮-硫酸比色法
中图分类号 S661.6 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）13-0018-03
Abstract：In this study，polysaccharides was isolated from papaya fruit by hot water extraction and alcohol deposit.In hot water extraction，extraction temperature，the ratio of material to solution，extraction time and the concentration of ethanol as the factors affecting extraction ratio were studied.The content of the polysaccharide was determinated by phenol sulfuric acid method.Orthogonal test was conducted to select the optimal conditions for the determination of polysaccharide from papaya fruit.The optimum conditions of papaya fruit were：the optimal temperature for 80℃ baptized mention，best liquid ratio for 1：60g/mL，best extraction time for 60 minutes，best ethanol concentration is 80%.Under these conditions，the extraction efficiency of polysaccharide was 5.6%.The feasibility and reliability of this optimum conditions were verified through experiments.The experiments had provided the strongest assurance on the study of polysaccharides content of Chaenomeles sinensis.
Key words：Papaya fruit；Extraction of polysaccharides；Orthogonal test；Anthrone-sulphuric acid colorimetry
1 引言
木瓜（Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne），又称皱皮木瓜、贴梗海棠，属蔷薇科木瓜属，主要产于山东、安徽、湖北等地[1]。木瓜具有多种功效，可以增强体质，降低血压，有一定作用肠胃，有效预防中暑[2]，改善脚气问题，治疗风湿病，还可以有效防治霍乱等疾病。木瓜含有许多有益于人体健康的成分，如维生素、糖类、矿物质、黄酮、蛋白酶类、多种有机酸等，有很高的药用价值和营养价值[3]。
木瓜多糖（stauntonia chinensis polysaccharides，SCP）是从药食两用植物木瓜中分离提取的重要活性成分，研究表明SCP具有显著的抗氧化活性，对实验性小鼠肝损伤有保护作用，而且木瓜多糖还能显著降低血小板的聚集，起到抗凝血的作用[4-7]。当前对多糖研究很多，但对木瓜多糖的提取工艺还缺乏系统的研究，本文通过热水浸提法和醇沉法提取多维1号木瓜果实多糖，利用正交设计法优化多维1号木瓜果实多糖的提取工艺，确定其多糖提取的最佳工艺条件，提高木瓜的经济价值和综合开发价值。
2 材料与方法
2.1 材料 多维1号木瓜的果实，2016年7月采购于安徽省黄山市休宁县多维科技有限公司。于烘箱中60℃烘制24h取出，粉碎，待用。
2.2 试剂 无水乙醇（江苏镇江长兴酒精有限公司），分析纯；蒽酮（上海科丰化学试剂有限公司），分析纯；浓硫酸（95%～98%，西陇化工股份有限公司），葡萄糖（中国医药集团上海化学试剂公司），分析纯。
2.3 主要仪器 DGX-9073B-2型电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；TJ-2型组织捣碎机（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；AE224型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；UV-765型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；TGL-16A台式高速冷冻离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；HH-6S型水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；电子万用电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）。
2.4 試验方法
2.4.1 木瓜果实多糖溶液的制备[8-11] 取干燥粉碎的多维1号木瓜粉1g，放入三角烧瓶中进行热水提取，隔一段时间进行振荡，然后倒入离心管中，在10℃，3500r/min条件下离心10min，取上清液过滤，过滤液加入3倍过滤体积的乙醇（不同浓度）沉淀，静置过夜，将其倒入蒸发皿中于电子万用电炉中蒸干，逐尽酒精，将蒸干的含糖残留物用蒸馏水复溶并转移至1000mL容量瓶中，定容摇匀，备用。 2.4.2 木瓜果实木瓜多糖含量测定[8-11] 每种样品精密称取2mL于25mL试管中，沿管壁缓慢加入8mL蒽酮试剂，边加边振荡，接着将试管连同试管架一起放入100℃水浴锅中进行加热10min，拿出来放入冷水中降温，温度接近室温即可，以加入蒸馏水的试管作为空白对照，利用分光光度计于620mm波长下测定吸光度。按下式计算多维1号木瓜多糖提取率：
[多糖提取率（%）=提取液中的多糖多量多维一号木瓜粉样品质量×100]
2.4.3 单因素试验 考察热水提取温度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、热水提取时间（30min、40min、50min、60min、70min）、料液比（1：50、1：60、1：70、1：80、1：90g/mL）、醇沉时乙醇浓度（50%，60%，70%，80%，90%）对多维1号木瓜多糖提取率的影响。
2.4.4 正交试验 通过单因素试验结果，选取热水提取温度、热水提取时间、料液比和醇沉时乙醇浓度4个因素最佳的水平，进行4因素3水平的正交试验，见表1。
3 结果与分析
3.1 单因素试验
3.1.1 不同料液比 由图1可知，在其他因素的水平不变的条件下，增加料液比，多维1号木瓜果实多糖的提取率也不断增加，当料液比为1：70g/mL时，多维1号木瓜果实多糖的提取率达到最大值5.19%，继续增加料液比，提取率下降，表明提取料液比过高会导致后续工作能耗增加、提取效率降低，在之后的单因素试验中控制料液比为1：70g/mL进行试验。选择料液比1：60g/mL、1：70g/ml、1：80g/mL作为正交试验的3个水平。
3.1.2 提取温度 由图2可知，在固定提取提取料液比1：70g/mL、提取時间30min、乙醇浓度50%的条件下，通过改变提取温度，多维1号木瓜果实多糖的提取率也不断改变，当提取温度达到80℃时，多维1号木瓜果实多糖的提取率达到最大值5.28%，当提取温度高于80℃时多维1号木瓜果实多糖提取率，现象表明提取温度过高造成了木瓜果实多糖的变性。在之后的单因素试验中控制提取温度为80℃进行试验。选择提取温度70℃、80℃、90℃作为正交试验的3个水平。
3.1.3 提取时间 由图3可知，在其他3个因素的水平不变的条件下，通过改变提取时间，多维1号木瓜果实多糖的提取率也不断改变，当提取时间达到60min时，多维1号木瓜果实多糖的提取率达到最大值5.42%，提取时间继续加长，木瓜果实多糖提取率有下降趋势，但是趋势不明显，考虑到提取时间过长会加长试验时间，拖延实验进程，因此热水提取时间不宜过长。在之后的单因素试验中控制提取时间为60min进行试验。选择提取时间50min、60min、70min作为正交试验的3个水平。
3.1.4 乙醇浓度 由图4可知，在其他3个因素的水平不变的条件下，通过改变乙醇浓度，多维1号木瓜果实多糖的提取率也在变化，当乙醇浓度达到80%时，多维1号木瓜果实多糖的提取率达到最大值5.47%，此后随着乙醇浓度的继续增大，木瓜果实多糖的提取率不断减小，说明乙醇浓度是影响木瓜果实多糖提取率的一个重要因素。选择乙醇浓度70%、80%、90%作为正交试验的3个水平。
3.2 正交试验
3.2.1 正交试验设计及其结果 正交试验结果如表2所示。
由表2可知，对多维1号木瓜果实多糖提取率的影响最显著的是提取温度，其次是料液比和提取时间，影响最小的是乙醇浓度。对多糖提取的各影响因素3个水平间优势为：A1>A2>A3，B2>B1>B3，C2>C1>C3，D2>D1>D3，得到用热水浸提法和醇沉法提取多维1号木瓜果实多糖的最佳工艺条件是：提取温度80℃，料液比1：60g/mL，提取时间60min，乙醇浓度80%。
3.2.2 正交试验结果的验证 由正交试验优选得提取木瓜多糖最佳工艺条件：提取温度80℃，料液比1：60g/mL，提取时间60min，乙醇浓度80%，在此条件下重复进行3次试验，试验结果见表3。
由表3可得3次平行试验多糖平均提取率为5.597%，与正交试验结果理论值接近，说明正交试验结果可靠。
4 结论与讨论
通过设计正交试验确定了木瓜果实多糖提取的最佳工艺条件：提取温度80℃，料液比1：60g/mL，提取时间60min，乙醇浓度80%，并对正交试验结果进行了3次平行试验验证，得出用正交设计法优化多维1号木瓜果实多糖的提取工艺具有可行性，结果具有可靠性，为木瓜多糖临床研究提供更有力工艺保证，并提高了多维1号木瓜的经济和综合开发价值。
参考文献
[1]唐春红，叶志义，项昭保，等.木瓜营养保健作用研究动态[J].天然产物研究与开发，2000，12（4）：97-100.
[2]董道顺.木瓜、山楂复合型保健酸奶的研制[J].贵州农业科学，2012，40（12）：187-190.
[3]刘捷，王文，卢奎，等.皱皮木瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].河南工业大学学报（自然科学版），2011，32（1）：48-52.
[4]张燕，张树淼，王飞，等.近年来植物多糖提取方法研究进展[J].农产品加工，2015，11：65-68，72.
[5]金迪，梁英，孙工兵，等.植物多糖提取技术的研究进展[J].黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（5）：76-79.
[6]王如涛，吴绵斌，林建平，等.植物多糖分离提取技术的研究进展[J].中国生物工程杂志，2013，07：118-123.
[7]舒任庚，蒋跃平，蔡永红.植物多糖的提取分离方法探讨[J].中国药房，2011，22（11）：1052-1055.
[8]张杰，李春艳，李劲平，等.蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法测定竹节参多糖含量的比较研究[J].中南药学，2012，10（6）：421-424.
[9]王佩芬，池源，王丽波. 蒽酮-硫酸比色法测定南瓜籽多糖含量[J]. 食品研究与开发，2014，35（24）：121-125.
[10]吴雪艳，罗鹏，叶建方，等. 响应面法优化竹荪菌托多糖的提取工艺[J]. 南方农业学报，2015，46（03）：480-485.
[11]沈海贝. 不同产地木瓜多糖含量的测定[J]. 现代医药卫生，2011，27（21）：3244-3245.
（责编：王慧晴）
关键词：木瓜；多糖提取；正交试验；蒽酮-硫酸比色法
中图分类号 S661.6 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）13-0018-03
Abstract：In this study，polysaccharides was isolated from papaya fruit by hot water extraction and alcohol deposit.In hot water extraction，extraction temperature，the ratio of material to solution，extraction time and the concentration of ethanol as the factors affecting extraction ratio were studied.The content of the polysaccharide was determinated by phenol sulfuric acid method.Orthogonal test was conducted to select the optimal conditions for the determination of polysaccharide from papaya fruit.The optimum conditions of papaya fruit were：the optimal temperature for 80℃ baptized mention，best liquid ratio for 1：60g/mL，best extraction time for 60 minutes，best ethanol concentration is 80%.Under these conditions，the extraction efficiency of polysaccharide was 5.6%.The feasibility and reliability of this optimum conditions were verified through experiments.The experiments had provided the strongest assurance on the study of polysaccharides content of Chaenomeles sinensis.
Key words：Papaya fruit；Extraction of polysaccharides；Orthogonal test；Anthrone-sulphuric acid colorimetry
1 引言
木瓜（Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne），又称皱皮木瓜、贴梗海棠，属蔷薇科木瓜属，主要产于山东、安徽、湖北等地[1]。木瓜具有多种功效，可以增强体质，降低血压，有一定作用肠胃，有效预防中暑[2]，改善脚气问题，治疗风湿病，还可以有效防治霍乱等疾病。木瓜含有许多有益于人体健康的成分，如维生素、糖类、矿物质、黄酮、蛋白酶类、多种有机酸等，有很高的药用价值和营养价值[3]。
木瓜多糖（stauntonia chinensis polysaccharides，SCP）是从药食两用植物木瓜中分离提取的重要活性成分，研究表明SCP具有显著的抗氧化活性，对实验性小鼠肝损伤有保护作用，而且木瓜多糖还能显著降低血小板的聚集，起到抗凝血的作用[4-7]。当前对多糖研究很多，但对木瓜多糖的提取工艺还缺乏系统的研究，本文通过热水浸提法和醇沉法提取多维1号木瓜果实多糖，利用正交设计法优化多维1号木瓜果实多糖的提取工艺，确定其多糖提取的最佳工艺条件，提高木瓜的经济价值和综合开发价值。
2 材料与方法
2.1 材料 多维1号木瓜的果实，2016年7月采购于安徽省黄山市休宁县多维科技有限公司。于烘箱中60℃烘制24h取出，粉碎，待用。
2.2 试剂 无水乙醇（江苏镇江长兴酒精有限公司），分析纯；蒽酮（上海科丰化学试剂有限公司），分析纯；浓硫酸（95%～98%，西陇化工股份有限公司），葡萄糖（中国医药集团上海化学试剂公司），分析纯。
2.3 主要仪器 DGX-9073B-2型电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；TJ-2型组织捣碎机（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；AE224型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；UV-765型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；TGL-16A台式高速冷冻离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；HH-6S型水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；电子万用电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）。
2.4 試验方法
2.4.1 木瓜果实多糖溶液的制备[8-11] 取干燥粉碎的多维1号木瓜粉1g，放入三角烧瓶中进行热水提取，隔一段时间进行振荡，然后倒入离心管中，在10℃，3500r/min条件下离心10min，取上清液过滤，过滤液加入3倍过滤体积的乙醇（不同浓度）沉淀，静置过夜，将其倒入蒸发皿中于电子万用电炉中蒸干，逐尽酒精，将蒸干的含糖残留物用蒸馏水复溶并转移至1000mL容量瓶中，定容摇匀，备用。 2.4.2 木瓜果实木瓜多糖含量测定[8-11] 每种样品精密称取2mL于25mL试管中，沿管壁缓慢加入8mL蒽酮试剂，边加边振荡，接着将试管连同试管架一起放入100℃水浴锅中进行加热10min，拿出来放入冷水中降温，温度接近室温即可，以加入蒸馏水的试管作为空白对照，利用分光光度计于620mm波长下测定吸光度。按下式计算多维1号木瓜多糖提取率：
[多糖提取率（%）=提取液中的多糖多量多维一号木瓜粉样品质量×100]
2.4.3 单因素试验 考察热水提取温度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、热水提取时间（30min、40min、50min、60min、70min）、料液比（1：50、1：60、1：70、1：80、1：90g/mL）、醇沉时乙醇浓度（50%，60%，70%，80%，90%）对多维1号木瓜多糖提取率的影响。
2.4.4 正交试验 通过单因素试验结果，选取热水提取温度、热水提取时间、料液比和醇沉时乙醇浓度4个因素最佳的水平，进行4因素3水平的正交试验，见表1。
3 结果与分析
3.1 单因素试验
3.1.1 不同料液比 由图1可知，在其他因素的水平不变的条件下，增加料液比，多维1号木瓜果实多糖的提取率也不断增加，当料液比为1：70g/mL时，多维1号木瓜果实多糖的提取率达到最大值5.19%，继续增加料液比，提取率下降，表明提取料液比过高会导致后续工作能耗增加、提取效率降低，在之后的单因素试验中控制料液比为1：70g/mL进行试验。选择料液比1：60g/mL、1：70g/ml、1：80g/mL作为正交试验的3个水平。
3.1.2 提取温度 由图2可知，在固定提取提取料液比1：70g/mL、提取時间30min、乙醇浓度50%的条件下，通过改变提取温度，多维1号木瓜果实多糖的提取率也不断改变，当提取温度达到80℃时，多维1号木瓜果实多糖的提取率达到最大值5.28%，当提取温度高于80℃时多维1号木瓜果实多糖提取率，现象表明提取温度过高造成了木瓜果实多糖的变性。在之后的单因素试验中控制提取温度为80℃进行试验。选择提取温度70℃、80℃、90℃作为正交试验的3个水平。
3.1.3 提取时间 由图3可知，在其他3个因素的水平不变的条件下，通过改变提取时间，多维1号木瓜果实多糖的提取率也不断改变，当提取时间达到60min时，多维1号木瓜果实多糖的提取率达到最大值5.42%，提取时间继续加长，木瓜果实多糖提取率有下降趋势，但是趋势不明显，考虑到提取时间过长会加长试验时间，拖延实验进程，因此热水提取时间不宜过长。在之后的单因素试验中控制提取时间为60min进行试验。选择提取时间50min、60min、70min作为正交试验的3个水平。
3.1.4 乙醇浓度 由图4可知，在其他3个因素的水平不变的条件下，通过改变乙醇浓度，多维1号木瓜果实多糖的提取率也在变化，当乙醇浓度达到80%时，多维1号木瓜果实多糖的提取率达到最大值5.47%，此后随着乙醇浓度的继续增大，木瓜果实多糖的提取率不断减小，说明乙醇浓度是影响木瓜果实多糖提取率的一个重要因素。选择乙醇浓度70%、80%、90%作为正交试验的3个水平。
3.2 正交试验
3.2.1 正交试验设计及其结果 正交试验结果如表2所示。
由表2可知，对多维1号木瓜果实多糖提取率的影响最显著的是提取温度，其次是料液比和提取时间，影响最小的是乙醇浓度。对多糖提取的各影响因素3个水平间优势为：A1>A2>A3，B2>B1>B3，C2>C1>C3，D2>D1>D3，得到用热水浸提法和醇沉法提取多维1号木瓜果实多糖的最佳工艺条件是：提取温度80℃，料液比1：60g/mL，提取时间60min，乙醇浓度80%。
3.2.2 正交试验结果的验证 由正交试验优选得提取木瓜多糖最佳工艺条件：提取温度80℃，料液比1：60g/mL，提取时间60min，乙醇浓度80%，在此条件下重复进行3次试验，试验结果见表3。
由表3可得3次平行试验多糖平均提取率为5.597%，与正交试验结果理论值接近，说明正交试验结果可靠。
4 结论与讨论
通过设计正交试验确定了木瓜果实多糖提取的最佳工艺条件：提取温度80℃，料液比1：60g/mL，提取时间60min，乙醇浓度80%，并对正交试验结果进行了3次平行试验验证，得出用正交设计法优化多维1号木瓜果实多糖的提取工艺具有可行性，结果具有可靠性，为木瓜多糖临床研究提供更有力工艺保证，并提高了多维1号木瓜的经济和综合开发价值。
参考文献
[1]唐春红，叶志义，项昭保，等.木瓜营养保健作用研究动态[J].天然产物研究与开发，2000，12（4）：97-100.
[2]董道顺.木瓜、山楂复合型保健酸奶的研制[J].贵州农业科学，2012，40（12）：187-190.
[3]刘捷，王文，卢奎，等.皱皮木瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].河南工业大学学报（自然科学版），2011，32（1）：48-52.
[4]张燕，张树淼，王飞，等.近年来植物多糖提取方法研究进展[J].农产品加工，2015，11：65-68，72.
[5]金迪，梁英，孙工兵，等.植物多糖提取技术的研究进展[J].黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（5）：76-79.
[6]王如涛，吴绵斌，林建平，等.植物多糖分离提取技术的研究进展[J].中国生物工程杂志，2013，07：118-123.
[7]舒任庚，蒋跃平，蔡永红.植物多糖的提取分离方法探讨[J].中国药房，2011，22（11）：1052-1055.
[8]张杰，李春艳，李劲平，等.蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法测定竹节参多糖含量的比较研究[J].中南药学，2012，10（6）：421-424.
[9]王佩芬，池源，王丽波. 蒽酮-硫酸比色法测定南瓜籽多糖含量[J]. 食品研究与开发，2014，35（24）：121-125.
[10]吴雪艳，罗鹏，叶建方，等. 响应面法优化竹荪菌托多糖的提取工艺[J]. 南方农业学报，2015，46（03）：480-485.
[11]沈海贝. 不同产地木瓜多糖含量的测定[J]. 现代医药卫生，2011，27（21）：3244-3245.
（责编：王慧晴）