【摘 要】
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目的 探讨核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)与血管生成素(angiogenin,ANG)的相互作用.方法 利用免疫荧光标记结合共聚焦显微镜技术来确立RI与ANG蛋白在细胞内
【机 构】
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400016 重庆,重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室,分子医学与肿瘤研究中心;
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目的 探讨核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)与血管生成素(angiogenin,ANG)的相互作用.方法 利用免疫荧光标记结合共聚焦显微镜技术来确立RI与ANG蛋白在细胞内的共定位.利用激光共聚焦显微镜的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术验证RI和ANG蛋白的相互作用.构建原核表达质粒pGEX-4T-RI,转化E coli BL21大肠杆菌(DE3)表达,并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(glutathione sepharose 4B)纯化GST-RI蛋白,考马斯亮蓝染色和免疫印迹鉴定表达情况,利用GST蛋白沉降技术检测RI与ANG蛋白在体外的结合作用.应用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验检测两蛋白在真核细胞内的结合作用.结果 细胞内免疫荧光标记的RI和ANG蛋白在激光共聚焦显微镜观察下存在共定位现象.FRET结果显示RI与ANG在细胞内存在相互作用.另外酶切和测序结果证明原核表达质粒pGEX-4T-RI构建成功,GST-RI蛋白诱导表达正确,GST蛋白沉降结果显示RI和ANG蛋白在原核细胞反应体系中存在相互作用.结论 RI和ANG蛋白在原核细胞反应体系和真核细胞中均存在相互结合作用.
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