【摘 要】
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目的研究培养Hep-2细胞中,靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的小干扰RNA表达框架(small interference RNA expression cassettes, SECs)对肿瘤细胞生长的影响,检测VEGF基因表达的情况,筛选最佳干扰序列,探讨RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用前景.方法根据siRNA靶序列设计原
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科,武汉430022,华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科,武汉430022,华中科技大学同济医学院附属协和医院病毒科,武汉430022,华中科技大学
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目的研究培养Hep-2细胞中,靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的小干扰RNA表达框架(small interference RNA expression cassettes, SECs)对肿瘤细胞生长的影响,检测VEGF基因表达的情况,筛选最佳干扰序列,探讨RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用前景.
方法根据siRNA靶序列设计原则,设计出VEGF 4个位点的干扰序列,然后进行合成,即为siRNA表达框架的下游引物.由于干扰试剂盒中采用RNA介导的U6聚合酶Ⅲ启动子和改良的终止序列,从而在靶细胞内可以高水平及精确地表达siRNA.我们将4个位点的PCR产物分别转染指数生长期的Hep-2细胞,48 h开始观察和检测所产生的RNA干扰的效果.
结果形态学检测:转染后的1366位点的细胞可见皱缩、变圆并开始脱落,而其他三个位点的细胞形态学上未见明显的改变;逆转录-聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,与对照组相比,1366位点细胞VEGF mRNA明显被抑制,吸光度为0.05,而其他三个位点的抑制效果不显著,吸光度分别是0.25、0.30和0.18.Western blot分析表明:与其他三个位点相比,1366位点的VEGF蛋白表达明显减弱;流式细胞仪检测表明: 1366位点转染细胞的凋亡率为43%,而其他三个位点转染细胞的凋亡率改变不明显,分别为8.9%、6.5%和11.2%;本实验重复性强,同样的实验重复三次结果一致.
结论研究表明靶向VEGF的1366位点的siRNA表达框架能高效抑制喉癌细胞株Hep-2细胞的生长.
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