【摘 要】
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【目的】植物原生质体瞬时表达系统可快速实现模拟胞内的基因表达、蛋白质亚细胞定位及验证基因生理生化功能的目的，所以建立高效玉米叶肉原生质体细胞瞬时表达系统具有重要的应用价值。【方法】本研究以玉米B73黄化苗叶片为研究材料，采用酶解法分离并获得高活性的玉米叶肉原生质体细胞；优化了PEG-Ca2+介导的玉米叶肉原生质体细胞转化条件，分析了PEG浓度及质粒用量对瞬时转化效率的影响；探索了电击介导玉米叶肉原
【基金项目】
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国家自然科学基金青年科学基金项目（32001551）；
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【目的】植物原生质体瞬时表达系统可快速实现模拟胞内的基因表达、蛋白质亚细胞定位及验证基因生理生化功能的目的，所以建立高效玉米叶肉原生质体细胞瞬时表达系统具有重要的应用价值。【方法】本研究以玉米B73黄化苗叶片为研究材料，采用酶解法分离并获得高活性的玉米叶肉原生质体细胞；优化了PEG-Ca2+介导的玉米叶肉原生质体细胞转化条件，分析了PEG浓度及质粒用量对瞬时转化效率的影响；探索了电击介导玉米叶肉原生质体细胞瞬时转化方法，剖析了转化过程中电压及电击时间对转化效率的影响；同时，以荧光蛋白为报告分子融合细胞器定位信号，建立了玉米叶肉原生质体亚细胞定位系统；以及通过在玉米叶肉原生质体细胞过表达ZmDHDPS基因，进一步验证了该瞬时表达系统所具备的可用于基因功能研究可能性。【结果】通过酶解法分离获得的玉米叶肉原生质体细胞经过FDA染色统计发现95﹪的细胞结构完整且活力较高；在PEG-Ca2+介导瞬时转化方法中，当PEG浓度40﹪且质粒量增加至25 μg时转化效率达到最高为51.28﹪；在电击介导瞬时转化方法中，当电压为350 V（875 V/cm）且电击时间为5 ms的条件下电击转化效率最高为32.66﹪；通过将核定位信号NLS与eGFP基因融合转入玉米叶肉原生质体细胞，研究发现eGFP成功定位于细胞核，通过将叶绿体定位基因ZmMSH1与DsRed2基因融合并转入玉米叶肉原生质体细胞，结果表明DsRed2蛋白成功定位于叶绿体中；在玉米叶肉原生质体细胞中过表达ZmDHDPS基因，通过qRT-PCR和Western Blot等技术确定了ZmDHDPS高表达活性，并显著提高原生质体细胞内游离赖氨酸含量。【结论】本研究利用酶解法建立了高活性的玉米叶肉原生质体细胞分离方法，探索并优化了PEG-Ca2+及电击介导米叶肉原生质细胞瞬时转化方法，为玉米的亚细胞定位及基因功能验证与分析等研究提供理论依据和技术支持。
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