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[摘 要] S-腺苷甲硫氨酸是广泛存在于生物体内的重要代谢中间物质，在体内参与DNA甲基化、蛋白质甲基化、多胺合成等众多的生物化学反应。在体内，S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化ATP和甲硫氨酸（Met）形成S-腺苷甲硫氨酸。本文参考苏云金芽孢杆菌基因组中S-腺苷甲硫氨酸合成酶序列信息设计引物，通过PCR技术从芽孢杆菌属B.thuringiensis Dip20株菌中扩增得到SAM合成酶基因片段，插入大肠杆菌融合表达载体pGEX-6p-1构建了表达载体pGEX-SAM。将所构建的SAM合成酶表达载体pGEX-SAM转入大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析表明成功表达了SAM合成酶。进一步通过亲和层析成功的纯化了SAM合成酶。
[关键词] 克隆；表达；S-腺苷甲硫氨酸合成酶；亲和层析；蛋白纯化
一、研究意义
S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是广泛存在于动物、植物和微生物体内的重要代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与了40多种生化反应。在生物体代谢网络中，S-腺苷甲硫氨酸的生物合成由S-腺苷甲硫氨酸合成酶[EC2.5.1.6]催化甲硫氨酸（Met）和ATP反应完成，即来自于ATP的腺苷部分攻击甲硫氨酸的硫原子，生成高能量、活泼的有机硫化合物，具有生物活性的（-）S-腺苷甲硫氨酸在体内主要起着转甲基、转硫、转氨丙基的作用。其中最主要的功能是作为甲基的供体参与甲基化作用，如蛋白质，核酸的甲基化等。同时在植物体内他还作为氨丙基的供体参与乙烯的合成。
二、材料与方法
1.菌株与质粒
大肠杆菌Escherichia coli DH5α，B.thuringiensis Dip20，质粒（plasmid）pGEX-6P-1，pGEX-SAM。
2.培养基及生化试剂
培养基：（1）LB（Luria- Bertani）培养基
质粒抽提试剂：（1）SolutionⅠ，（2）SolutionⅡ，（3）Solution Ⅲ（4）PBS缓冲液（pH7.4）：（5）氨苄青霉素。限制性内切酶，PCR引物。
三、方法步骤
B.thuringiensis Dip20总DNA的提取：将B.thuringiensis Dip20接种于5mL LB培养基中，37℃、220 r/min培养16h以上。取培养物1.5mL离心收集菌体。加入567μLTE缓冲液，30μL 10%SDS，3μL蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h。加入100μL5M NaCl，混匀，再加入80μL CTAB，混匀，70℃水浴10min。加入0.7倍体积的氯仿-异戊醇混匀。离心5min。转移上层亲水相，加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇，离心5min。再将上层水相转移到新的离心管中，并加入0.6体积的异丙醇，冰上5min。然后12000r/min离心5min，沉淀重悬与50μLTE缓冲液中。加入1μL RNA酶，37℃作用15min。取5μL 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测基因组提取结果。
PCR的基本反应步骤：（1）变性——将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；（2）退火（anneal）——将温度下降至适宜温度使引物与模板DNA退火结合；（3）延伸，将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。
PCR产物纯化与酶切：将PCR扩增得到的PCR产物，通过0.7%琼脂糖凝胶电泳回收1200bp条带，DNA凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物以0.7%琼脂糖凝胶检测。纯化后的PCR产物进行与XhOⅠ双酶切。
pGEX-S-腺苷甲硫氨酸合成酶表达载体的构建：将经过BamHⅠ与XhoⅠ双酶切的pGEX-6p-1载体与PCR扩增片段按约3：1的摩尔混合，混勻后，4℃连接12h后转化大肠杆菌DH5α超级感受态，由于pGEX-6p-1有氨苄青霉素抗性，因此在含100μg/mL氨苄青霉素LB平板培养基上筛选阳性克隆。
感受态细胞的制备与酶物的连产转化：1﹒取保存的菌接种于LB固体培养基，37°C培养过夜（不超16h）。2﹒挑取单菌落至5mLLB液体培养基，37°C，200r/min培养过夜。3﹒按1：100取1mL培养菌液转入100mL LB液体培养基中，37℃，250r/min培养至OD600=0.3至0.4，立刻置于冰上10min（冰上操作要轻柔，避免较大的振荡）。4﹒4000rpm离心5min去上清，加入2.5mL 0.1M Mg2SO4溶液，悬浮沉淀，冰浴15min。5﹒4000rpm离心5min，去上清，加入2.5mL 0.1M CaCl2及15%甘油，悬浮沉淀。6﹒以200ul每管分装，-70C保存备用。
转化：1﹒取上述制备的感受态一只200ul。2﹒加入酶连产物10ul，轻轻摇匀。冰上放置30min。3﹒42℃水浴热击90s，冰上放置3min。4﹒加入1mL LB液体培养基（不含Ap+），混匀37℃摇床（200 rpm）复苏1h。5﹒取500ul菌液涂含有Ap+的LB培养基平板，正面放置待完全吸收变干后在37℃倒置培养过夜。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶诱导表达：从转化的大肠杆菌中挑取单个菌落，接种于A+（终浓度为50ug/mL）的10mL LB的50mL的离心管中，放置37℃恒温摇床中，200r/min培养过夜。2.按1%比例接入到1000mL 含A+（终浓度为50ug/mL）的LB培养液中。在37℃和200r/min条件下培养。3.培养2h后测OD600值，当OD600≈0.8时加入终浓度为0.5mol/ITPG诱导表达，经过28℃，200r/min摇床诱导三小时。4﹒将诱导后的培养液分装到4个250mL的离心管中，于4℃4000r/min离心10min。5﹒到掉上层培养液，用PBS洗沉淀菌体，打散混匀。在4℃4000r/min离心10min。再重复一次。6.收集4只离心管中菌体，保存4℃条件下保存备用。 S-腺苷甲硫氨酸合成酶的纯化：将收集到的菌体PBS（pH7.4，50mL）缓冲液重悬，以2000psi.破碎细胞。破碎液以15000 r/min离心15min，取上清。所有操作在冰上进行。取1mLSepharose 4B于纯化柱内，以PBS（pH7.4）缓冲液平衡柱床。将上述上清液加样于柱内，以PBS（pH7.4）缓冲液洗涤柱床4h，将柱内液面与柱床齐平，加入蛋白酶3C（用前用PBS）缓冲液稀释，过夜。然后加入2mLPBS4（pH7.4，50mL）缓冲液，收集洗脱液，即为含目的蛋白溶液。所有操作于4℃进行。纯化的蛋白经过10% SDS-PAGE电泳，考马斯蓝染色检测。
四、讨论
1.为了提高转化效率，实验中要考虑以下四个重要因素
（1）细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好直接用–70℃或–20℃甘油保存的菌种制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
（2）质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
（3）试剂的质量：所用的试剂如 CaCl2等均需是最高纯度的（GR.或AR.），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
（4）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
2.纯化蛋白方法的选择
纯化蛋白方法的选择要从几个方面考虑。首先是纯化效率，通过几种纯化方法的比较，要想得到高纯度的蛋白最好采用亲和层析来纯化蛋白；其次是费用问题，相对来说亲和层析比一般蛋白纯化方法贵，如本体积较大就不宜采取亲和层析，本实验中收集到的菌体事先通过破碎细胞、离心，对SAM合成酶蛋白进行了粗分离。此时收集的上清体积不大，且大部分雜质在上粗分离已经除去，可采用亲和层析。最后亲和层析方法简便，易于操作。
参考文献
[1] 王学奎.植物生理生化实验原理与技术.北京：科学出版社.2006
[2] 王金霞，谭海东，赵宗保.大肠杆菌K12苹果酸酶的克隆、表达与纯化.生物加工过程.2006，2（4）：35～38
[3] 王晓玲，叶林柏等.HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯.武汉大学学报.2001，147（14）：468～470
[4] 王友如.大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化.生物技术.2006，116（16）：42～44
[5] 李杨，韩梅.亲和层析技术在生物科学中的应用及发展.生命科学研究，2006，10（1）：12～16
[6] 李洪利，黄周丽.亲和层析技术在现代蛋白质.海洋湖沼通报.2005，（3）：86～92
[7] 向左云，郑颖等.蛋白质凝胶过滤色谱上样方法的改进.生物技术通讯.2002，13（1）：38-41
[8] 许亚平，林俊岳.蛋白质提纯研究进展.天津化工.2006，7（20）：9-11
[9] 余志良，蔡谨，袁中一.S－腺苷甲硫氨酸的研究进展.中国医药工业杂志.2003，3（1）：49～52
[10] 苏昕，阎浩林，梁丽莉.酵母SOD分离纯化及其酶学性质的研究.沈阳药科大学学报.2005，122（11）：167
[11] 苏俊，张国政，刘忠华.蛋白质在分离纯化中保持稳定的方法及应用.天津轻工业学院学报.2002，3（1）：21～24
[关键词] 克隆；表达；S-腺苷甲硫氨酸合成酶；亲和层析；蛋白纯化
一、研究意义
S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是广泛存在于动物、植物和微生物体内的重要代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与了40多种生化反应。在生物体代谢网络中，S-腺苷甲硫氨酸的生物合成由S-腺苷甲硫氨酸合成酶[EC2.5.1.6]催化甲硫氨酸（Met）和ATP反应完成，即来自于ATP的腺苷部分攻击甲硫氨酸的硫原子，生成高能量、活泼的有机硫化合物，具有生物活性的（-）S-腺苷甲硫氨酸在体内主要起着转甲基、转硫、转氨丙基的作用。其中最主要的功能是作为甲基的供体参与甲基化作用，如蛋白质，核酸的甲基化等。同时在植物体内他还作为氨丙基的供体参与乙烯的合成。
二、材料与方法
1.菌株与质粒
大肠杆菌Escherichia coli DH5α，B.thuringiensis Dip20，质粒（plasmid）pGEX-6P-1，pGEX-SAM。
2.培养基及生化试剂
培养基：（1）LB（Luria- Bertani）培养基
质粒抽提试剂：（1）SolutionⅠ，（2）SolutionⅡ，（3）Solution Ⅲ（4）PBS缓冲液（pH7.4）：（5）氨苄青霉素。限制性内切酶，PCR引物。
三、方法步骤
B.thuringiensis Dip20总DNA的提取：将B.thuringiensis Dip20接种于5mL LB培养基中，37℃、220 r/min培养16h以上。取培养物1.5mL离心收集菌体。加入567μLTE缓冲液，30μL 10%SDS，3μL蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h。加入100μL5M NaCl，混匀，再加入80μL CTAB，混匀，70℃水浴10min。加入0.7倍体积的氯仿-异戊醇混匀。离心5min。转移上层亲水相，加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇，离心5min。再将上层水相转移到新的离心管中，并加入0.6体积的异丙醇，冰上5min。然后12000r/min离心5min，沉淀重悬与50μLTE缓冲液中。加入1μL RNA酶，37℃作用15min。取5μL 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测基因组提取结果。
PCR的基本反应步骤：（1）变性——将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；（2）退火（anneal）——将温度下降至适宜温度使引物与模板DNA退火结合；（3）延伸，将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。
PCR产物纯化与酶切：将PCR扩增得到的PCR产物，通过0.7%琼脂糖凝胶电泳回收1200bp条带，DNA凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物以0.7%琼脂糖凝胶检测。纯化后的PCR产物进行与XhOⅠ双酶切。
pGEX-S-腺苷甲硫氨酸合成酶表达载体的构建：将经过BamHⅠ与XhoⅠ双酶切的pGEX-6p-1载体与PCR扩增片段按约3：1的摩尔混合，混勻后，4℃连接12h后转化大肠杆菌DH5α超级感受态，由于pGEX-6p-1有氨苄青霉素抗性，因此在含100μg/mL氨苄青霉素LB平板培养基上筛选阳性克隆。
感受态细胞的制备与酶物的连产转化：1﹒取保存的菌接种于LB固体培养基，37°C培养过夜（不超16h）。2﹒挑取单菌落至5mLLB液体培养基，37°C，200r/min培养过夜。3﹒按1：100取1mL培养菌液转入100mL LB液体培养基中，37℃，250r/min培养至OD600=0.3至0.4，立刻置于冰上10min（冰上操作要轻柔，避免较大的振荡）。4﹒4000rpm离心5min去上清，加入2.5mL 0.1M Mg2SO4溶液，悬浮沉淀，冰浴15min。5﹒4000rpm离心5min，去上清，加入2.5mL 0.1M CaCl2及15%甘油，悬浮沉淀。6﹒以200ul每管分装，-70C保存备用。
转化：1﹒取上述制备的感受态一只200ul。2﹒加入酶连产物10ul，轻轻摇匀。冰上放置30min。3﹒42℃水浴热击90s，冰上放置3min。4﹒加入1mL LB液体培养基（不含Ap+），混匀37℃摇床（200 rpm）复苏1h。5﹒取500ul菌液涂含有Ap+的LB培养基平板，正面放置待完全吸收变干后在37℃倒置培养过夜。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶诱导表达：从转化的大肠杆菌中挑取单个菌落，接种于A+（终浓度为50ug/mL）的10mL LB的50mL的离心管中，放置37℃恒温摇床中，200r/min培养过夜。2.按1%比例接入到1000mL 含A+（终浓度为50ug/mL）的LB培养液中。在37℃和200r/min条件下培养。3.培养2h后测OD600值，当OD600≈0.8时加入终浓度为0.5mol/ITPG诱导表达，经过28℃，200r/min摇床诱导三小时。4﹒将诱导后的培养液分装到4个250mL的离心管中，于4℃4000r/min离心10min。5﹒到掉上层培养液，用PBS洗沉淀菌体，打散混匀。在4℃4000r/min离心10min。再重复一次。6.收集4只离心管中菌体，保存4℃条件下保存备用。 S-腺苷甲硫氨酸合成酶的纯化：将收集到的菌体PBS（pH7.4，50mL）缓冲液重悬，以2000psi.破碎细胞。破碎液以15000 r/min离心15min，取上清。所有操作在冰上进行。取1mLSepharose 4B于纯化柱内，以PBS（pH7.4）缓冲液平衡柱床。将上述上清液加样于柱内，以PBS（pH7.4）缓冲液洗涤柱床4h，将柱内液面与柱床齐平，加入蛋白酶3C（用前用PBS）缓冲液稀释，过夜。然后加入2mLPBS4（pH7.4，50mL）缓冲液，收集洗脱液，即为含目的蛋白溶液。所有操作于4℃进行。纯化的蛋白经过10% SDS-PAGE电泳，考马斯蓝染色检测。
四、讨论
1.为了提高转化效率，实验中要考虑以下四个重要因素
（1）细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好直接用–70℃或–20℃甘油保存的菌种制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
（2）质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
（3）试剂的质量：所用的试剂如 CaCl2等均需是最高纯度的（GR.或AR.），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
（4）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
2.纯化蛋白方法的选择
纯化蛋白方法的选择要从几个方面考虑。首先是纯化效率，通过几种纯化方法的比较，要想得到高纯度的蛋白最好采用亲和层析来纯化蛋白；其次是费用问题，相对来说亲和层析比一般蛋白纯化方法贵，如本体积较大就不宜采取亲和层析，本实验中收集到的菌体事先通过破碎细胞、离心，对SAM合成酶蛋白进行了粗分离。此时收集的上清体积不大，且大部分雜质在上粗分离已经除去，可采用亲和层析。最后亲和层析方法简便，易于操作。
参考文献
[1] 王学奎.植物生理生化实验原理与技术.北京：科学出版社.2006
[2] 王金霞，谭海东，赵宗保.大肠杆菌K12苹果酸酶的克隆、表达与纯化.生物加工过程.2006，2（4）：35～38
[3] 王晓玲，叶林柏等.HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯.武汉大学学报.2001，147（14）：468～470
[4] 王友如.大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化.生物技术.2006，116（16）：42～44
[5] 李杨，韩梅.亲和层析技术在生物科学中的应用及发展.生命科学研究，2006，10（1）：12～16
[6] 李洪利，黄周丽.亲和层析技术在现代蛋白质.海洋湖沼通报.2005，（3）：86～92
[7] 向左云，郑颖等.蛋白质凝胶过滤色谱上样方法的改进.生物技术通讯.2002，13（1）：38-41
[8] 许亚平，林俊岳.蛋白质提纯研究进展.天津化工.2006，7（20）：9-11
[9] 余志良，蔡谨，袁中一.S－腺苷甲硫氨酸的研究进展.中国医药工业杂志.2003，3（1）：49～52
[10] 苏昕，阎浩林，梁丽莉.酵母SOD分离纯化及其酶学性质的研究.沈阳药科大学学报.2005，122（11）：167
[11] 苏俊，张国政，刘忠华.蛋白质在分离纯化中保持稳定的方法及应用.天津轻工业学院学报.2002，3（1）：21～24