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目的研究卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K15P蛋白对参与血管组成的内皮细胞、平滑肌细胞增殖迁移的作用,以及这些作用同钙库操控钙内流(SOCE)之间的相互关系。进一步深入了解K15P蛋白促进细胞增殖和迁移的分子机制。方法(1)操作第三代慢病毒包装体系,制备慢病毒颗粒:分析含有K15P及其突变体序列的重组质粒p FJ-K15P、p FJ-K15P(YF),设计合成引物。通过PCR扩增目的片段,使用限制性内切酶Not I与Bam H I酶切和TA克隆法构建T载体与慢病毒表达载体p HAGE-CMV-MCS-K15P-Puro、p HAGE-CMV-MCS-K15P(YF)-Puro,使用脂质体转染法将构建好的慢病毒表达载体与两种辅助包装质粒PSPAX2和p MD2.g共转染,培养共转染后的HEK 293T细胞,48~36 h后收集含有病毒颗粒上清液保存。(2)内皮细胞的感染与稳定表达株的筛选:利用慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(EA.hy926),通过嘌呤霉素对细胞进行筛选,获得具有嘌呤霉素抗性的细胞株,Western blot检测K15P与K15P(YF)蛋白的表达。(3)K15P蛋白的作用与SOCE之间的关系:培养稳定K15P与K15P(YF)蛋白的EA.hy926细胞,通过钙离子激动剂ATP引起细胞内钙释放,激活SOCE,通过单波长荧光法分别对慢病毒对照组、慢病毒K15P(YF)组和慢病毒K15P感染的内皮细胞内钙离子浓度的变化检测。使用双波长荧光法检测三种EA.hy 926细胞在静息状态下细胞质钙离子浓度水平。(4)K15P蛋白与细胞增殖和迁移:利用CCK-8试剂盒检测三种EA.hy 926细胞的增殖活性。细胞迁移实验(Transwell)观察三种慢病毒感染EA.hy 926细胞引起的细胞迁移变化以及三种慢病毒感染的EA.hy 926细胞共培养的人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC)的迁移变化。Western blot检测内皮、平滑肌细胞共培养体系中三种慢病毒感染的EA.hy 926细胞对HUVSMCα-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)表达的影响,CCK-8试剂盒检测HUVSMC的增殖情况。结果(1)通过酶切、送测序,成功构建含有K15P及其突变体基因片段的重组质粒,应用脂质体转染法将重组慢病毒表达载体与两种辅助质粒PSPAX2和p MD2.g共转染,通过在HEK 293T细胞内的组装,获得相应的慢病毒颗粒。(2)经慢病毒感染后的EA.hy926细胞,通过嘌呤霉素筛选后可稳定表达嘌呤霉素抗性,Western blot检测到感染病毒的EA.hy926细胞中K15P蛋白的稳定表达。(3)在EA.hy 926细胞中,表达K15P的细胞与空载体对照、表达K15P(YF)的细胞相比,细胞内钙离子浓度明显升高,钙库释放明显减弱,而SOCE明显增强。(4)在EA.hy 926细胞中,K15P组与对照组和K15P突变体组相比,细胞增殖活性和迁移能力明显增强。与表达K15P的EA.hy 926细胞共培养的HUVSMC,细胞的α-SM-actin表达量减少,增殖活性和迁移能力也有一定的增强。结论构建含有K15P、K15P(YF)基因片段的慢病毒表达载体,成功建立可以高效表达K15P蛋白及其突变体的第三代慢病毒系统。筛选出稳定表达K15P蛋白及其突变体的内皮细胞株。K15P能促进内皮细胞的增殖迁移,促进内皮细胞对共培养的平滑肌细胞的增殖和迁移作用。K15P能增加内皮细胞胞质内钙离子浓度以及增强SOCE。