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摘要：本实验为掌握聚维酮碘对中华绒鳌蟹蟹种的半致死剂量（LD50）。通过预实验，得到实验剂量的上限剂量对数值（Xk）和下限剂量对数值（Xi），实验组间距（d），再确定实验组药物浓度。实验设1个对照组，7个实验组药物浓度分别为15.85，19.50，23.99，29.51， 36.31， 44.67和54.95 mg/L。每个实验组放置雌、雄蟹蟹种各10只，平均体重（5.95±0.48） g。以一次性给药方式，观察和记录24 h和48 h实验蟹种的死亡情况。实验数据采用SAS统计软件中概率单位程序进行概率回歸分析。实验结果显示，7个实验组聚维酮碘对中华绒鳌蟹蟹种24 h急性毒性试验死亡率分别为0、0、0.15%、0.35%、0.85%、0.95%、100.0%、100.0%。直线回归方程：Y=-16.104 1 +11.519 2 log（Dose）， R2=0.897 4（P>0.8）。24 h半致死剂量（LD50）为25004 86 mg/L，95%可置信区间23.313 96～26.806 31 mg/L。48 h对照组和实验组实验蟹种在24 h基础上均无死亡。
关键词：聚维酮碘；中华绒鳌蟹；蟹种；急性毒性；SAS
聚维酮碘（povidone-iodum，PVP-I）又称碘伏、强力碘等。是以高分子聚合物聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为载体与碘络合而成的不定型络合碘，具有很好的水溶性和稳定性。聚维酮碘以结合碘形式存在，只有少部分为游离碘，在溶剂中逐渐释放游离碘，起到缓释作用，具有极强的杀菌力和广泛的杀菌谱[1-3]。聚维酮碘曾选用于美国阿波罗航天计划太空实验室消毒而闻名于世，被美国药典、英国药典、日本药典、马丁代尔药典和《中华人民共和国药典》载入，是国际公认的高效、广谱、无毒的消毒杀菌产品。
中华绒鳌蟹（Eriocheir sinensis）为我国淡水养殖主要经济动物，其生活周期有三个阶段[4]。在海水中孵出经脱壳变态为大眼幼体，淡化后在淡水中变态生长为蟹种，最后养成为成蟹。各生长阶段面临着生理、生物和机械等不安全因素的影响。为获得安全和便于操作的中华绒鳌蟹蟹种消毒药物，实验选择聚维酮碘，通过对蟹种的急性毒性试验，了解和掌握聚维酮碘对中华绒鳌蟹蟹种的半致死剂量（LD50）。旨在为中华绒鳌蟹养殖过程中的消毒和疾病预防提供依据和指导。
1料与方法
1.1实验材料
实验药物聚乙烯吡咯烷酮络合碘（C6H9I2NO），上海阿拉丁生化科技股份有限公司试剂级产品。中华绒鳌蟹取自江苏省淡水水产研究所高淳河蟹养殖基地培育的长江双年系F1代蟹种。实验用水为曝气自来水。玻璃水族箱大小为（90×30）cm。
1.2实验方法
1.2.1急性毒性试验实验中华绒鳌蟹蟹种选择无病症、步足完整的健康个体。实验室暂养7 d，投喂蛋白含量为32%，青岛六和水产饲料有限公司生产的蟹种配合饲料。实验前停食1 d，排空肠道，实验期间不喂食。实验水体体积0.29 m3，水深10 cm，pH值6.5～8.5，水温19.3 ℃。24 h气泵充气，确保溶氧5.0 mg/L以上。实验采用一次性给药，观察和记录24 h和48 h实验蟹种的死亡情况，以玻棒轻触实验蟹种不动即判断为死亡。
实验设1个对照组，7个药物剂量组。每个实验剂量组放置雌蟹蟹种和雄蟹蟹种各10只。预实验设8个药物剂量为0，8.0，16.0，20.0，250，32.0，64.0和128.0 mg/L。根据预实验结果，确定实验剂量的上限剂量对数值（Xk）和下限剂量对数值（Xi），依据实验组间距公式d =（Xk-Xi）/（G-1），[d<0.155（0.08～0.10）]，计算实验组药物的对数剂量。
1.2.2实验数据分析实验数据采用SAS/STAT13.1统计软件中概率单位程序（PROBIT Procedure）进行概率回归分析[5]。概率单位程序选择以药物对数剂量[log10（Dose）]作为自变量，死亡概率单位为应变量，利用最大可能率估计法找出回归模型的参数估计值，建立直线回归方程模型：Y = b0 + b1×log10（DOSE）。模型的适合度和概率值的95%置信区间，分别由选项LACKFIT和INVERSRCL定界。最后根据模型估算的概率值与实际估算值进行比较，以PREDPPLOT图表示两者间的吻合程度。
设药物分组标志为A，剂量为DOSE，各次试验的死亡数为R，试验动物数为N，计算药物的半致死剂量（LD50）。
SAS程序：
DATA a；
Input a dose r n；
PROC PROBIT LOG10；
MODEL r/n=dose/LACKFIT INVERSECL；
BY A；
RUN。
2结果
2.1实验药物剂量的确定
实验蟹种平均体重（4.56±0.53） g。24 h对照组死亡率为0。根据7个药物剂量组24 h死亡率，选取16.0，20.0，25.0，29.0和55.0 mg/L为有效实验药物剂量（表1）。
2.2聚维酮碘对中华绒鳌蟹蟹种的急性毒性影响
实验蟹种平均体重（5.95±0.48）g。24 h急性毒性试验对照组和15.85 mg/L药物剂量组死亡数为0。19.50、23.99、29.51和36.31 mg/L药物剂量组死亡数分别为3、7、17和19只。4467 mg/L和54.95 mg/L药物剂量组死亡数均为20只。由此得到，24 h聚维酮碘对中华绒鳌蟹蟹种死亡率分别为0、0.15%、0.35%、085%、0.95%、100.0%、100.0%。48 h对照组和实验组实验蟹种在24 h基础上均无死亡。 3讨论
聚乙烯吡咯烷酮本身没有抗菌作用，与碘络合后碘在表面活性剂中的缓慢释放，不仅增加了碘的溶解度，同时提高了碘溶液的穿透能力，达到持久消毒杀菌作用。聚维酮碘是唯一被中国药典收载的含碘消毒制剂，对大部分细菌，真菌和病毒均有不同的抑菌和杀菌作用[6，7]。根据《化学农药环境安全评价试验准则》（GB/T 31270.12-2014）中农药对鱼类等级划分标准，聚维酮碘为低毒类药物。《危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法》（GB/T 21281-2007）中，聚维酮碘为急性毒性Ⅲ级。聚维酮碘性状稳定，使用简便，杀菌作用持久，刺激性低，不产生二次污染，无残留毒性的特点，在水產经济动物养殖中主要用于鱼卵、苗种和疾病防治的杀菌消毒[8-12]。
急性毒性试验是评价毒物最直接的方法。聚维酮碘对甲壳类养殖动物幼体的毒性研究中，郭永军[13]、熊斌[14]和李飞[15]等分别对凡纳滨对虾仔虾、南美白对虾仔虾和青虾幼虾进行了毒性研究报道。本次实验主要针对中华绒鳌蟹蟹种进行了24 h急性毒性试验，SAS/STAT13.1统计软件分析实验数据，得到直线回归方程：Y=-16104 1 + 11.519 2 log10（Dose）， 24 h半致死剂量（LD50）值为25.00486 mg/L，95%可置信区间为23.313 96～26.806 31 mg/L。实验结果低于与刘庆坤[16]对三疣梭子蟹大眼幼体和Ⅰ仔蟹24 h LD50 36.661 mg/L和35.467 mg/L，盐度是否对聚维酮碘有效碘稳定性产生影响还待进一步进行实验探讨。
实验统计学计算半致死剂量（LD50）的方法很多，如目测法、改良冠氏法、序贯法、概率单位-对数图解法、加权直线回归法（Bliss）法等[17]。Bliss法是毒理学研究中常用的数据分析方法，SAS软件分析系统中可以调用PROBIT过程来实现Bliss法。
本次实验数据采用国际公认的大型集成标准应用软件SAS（statistical analysis system）软件包编写程序[17-18]。数据语言程序建立临时数据集a，输入顺序为药物剂量（does），死亡数（n），实验动物数（r）。调用PROBIT过程，选择LOG10为药物剂量取常用对数。MODEL语句以LACKFIT要求对失似进行检验；INVERSECL求出用原始药物剂量所表达的各种反应剂量。BY语句要求按分组剂量A分别计算。参数的估计通过概率单位（PROBIT Procedure）程序进行概率回归分析，实验数据与函数值间的似合度，以皮尔逊卡方检验（Pearson Chi-Square）和L.R卡方检验（L.R.Chi-Square） 2种方法对曲线失似进行检验分析。检验结果P值均大于0.05，似合优度检验结果支持PROBIT模型。
曲线似合检验采用概率单位法分析，以对数药物剂量作为自变量，死亡概率为应变量，得到直线回归方程。同时进行了参数的假设检验，得到直线回归方程中截距（a），斜率（b）与对数半致死剂量（μ）、标准差（σ）间的关系。PREDPPLOT图选项与ODS图形观察符合正态的公差分布，曲线的似合效果是满意的。
运用SAS软件进行实验数据统计分析，大大简化了繁锁的运算，运算精密度高，使用者只需根据实验数据更改程序的数据部分，结果更加可靠。
参考文献：
[1] 徐庆华.含碘消毒剂及其应用技术[J].中国消毒学杂志，2012，29（4）：316-318
[2] 郎轶咏，王强，刘兰娣.聚维酮碘溶液稳定性的研究[J].中国医院药学杂志，2008，28（17）：1523-1525
[3] 姜山，周大勇，魏淑贞.提高聚维酮碘溶液稳定性的方法[J].中国医院药学杂志，2002，22（3）：189-190
[4] 王武，李应森.河蟹生态养殖[M].北京：中国农业出版社，2010：38-50
[5] SAS Institute Inc.SAS/STA User’s Cuide.Version.Fourth Edition[M].North Carolina，USA.SAS Institute Inc.1994
[6] 周建标，周云柏，王之法.聚维酮碘在消毒和抗感染中的应用[J].药学实践杂志，1999，17（5）：271-273
[7] 王玲，徐燕，陈越英，等.一种聚维酮碘消毒液对微生物杀灭效果的实验研究[J].中国消毒学杂志，2007（2）：135-137
[8] Satyanarayan S，Bejankiwar R S，Chaudhari P R，et al.Impact of some chlorinated pesticides on the haematology of the fish Cypinus carpio and Puntius ticto[J].Journal of Environmental Sciences.2004，16（4）：631-634
[9] 陈月英，沈智华.用125I研究碘和pvp-碘在草鱼体内的浓度[J].大连水产学院学报，1993，8（4）：30-36
[10] 刘荭，王侃，彭锦新.碘伏对水生动物细菌和真菌病原杀灭效果的研究[J].中国动物检疫，1999，14（4）：7-9
[11] 李清禄，陈强，蔡春标.新型水产养殖消毒剂的制备、性能及其临床应用I.碘伏[J].福建农业大学学报，2000，29（4）：508-513
[12] 黄辨非，阮国良，缪有玲. 2种碘制剂对异育银鲫鱼苗的急性毒性试验[J].长江大学学报（自然版），2005，2（11）：60-63
[13] 郭永军，白东清，董少杰，等.3种药物对凡纳滨对虾仔虾的毒性研究[J].安徽农业科学，2010，38（3）：1297-1299，1302
[14] 熊斌.聚维酮碘和高锰酸钾对南美白对虾仔虾的急性毒性试验[J].河北渔业，2014（4）：8-10
[15] 李飞，郭建林，张宇飞，等.4种常用药物对青虾幼虾的毒性研究[J].生物学杂志，2013，30（6）：62-65
[16] 刘庆坤，姜玉声，丛方虎，等.聚维酮碘对三疣梭子蟹大眼幼体及仔蟹的急性毒性研究[J].水产科学，2011，30（9）：563-567
[17] 高惠璇，李贵斌，耿直，等编译.SAS系统SAS/STAT软件、SAS/BASE软件使用手册[M].北京：中国统计出版社，1997
[18] 金丕焕.医用统计方法[M].上海：上海医科大学出版社，1993
关键词：聚维酮碘；中华绒鳌蟹；蟹种；急性毒性；SAS
聚维酮碘（povidone-iodum，PVP-I）又称碘伏、强力碘等。是以高分子聚合物聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为载体与碘络合而成的不定型络合碘，具有很好的水溶性和稳定性。聚维酮碘以结合碘形式存在，只有少部分为游离碘，在溶剂中逐渐释放游离碘，起到缓释作用，具有极强的杀菌力和广泛的杀菌谱[1-3]。聚维酮碘曾选用于美国阿波罗航天计划太空实验室消毒而闻名于世，被美国药典、英国药典、日本药典、马丁代尔药典和《中华人民共和国药典》载入，是国际公认的高效、广谱、无毒的消毒杀菌产品。
中华绒鳌蟹（Eriocheir sinensis）为我国淡水养殖主要经济动物，其生活周期有三个阶段[4]。在海水中孵出经脱壳变态为大眼幼体，淡化后在淡水中变态生长为蟹种，最后养成为成蟹。各生长阶段面临着生理、生物和机械等不安全因素的影响。为获得安全和便于操作的中华绒鳌蟹蟹种消毒药物，实验选择聚维酮碘，通过对蟹种的急性毒性试验，了解和掌握聚维酮碘对中华绒鳌蟹蟹种的半致死剂量（LD50）。旨在为中华绒鳌蟹养殖过程中的消毒和疾病预防提供依据和指导。
1料与方法
1.1实验材料
实验药物聚乙烯吡咯烷酮络合碘（C6H9I2NO），上海阿拉丁生化科技股份有限公司试剂级产品。中华绒鳌蟹取自江苏省淡水水产研究所高淳河蟹养殖基地培育的长江双年系F1代蟹种。实验用水为曝气自来水。玻璃水族箱大小为（90×30）cm。
1.2实验方法
1.2.1急性毒性试验实验中华绒鳌蟹蟹种选择无病症、步足完整的健康个体。实验室暂养7 d，投喂蛋白含量为32%，青岛六和水产饲料有限公司生产的蟹种配合饲料。实验前停食1 d，排空肠道，实验期间不喂食。实验水体体积0.29 m3，水深10 cm，pH值6.5～8.5，水温19.3 ℃。24 h气泵充气，确保溶氧5.0 mg/L以上。实验采用一次性给药，观察和记录24 h和48 h实验蟹种的死亡情况，以玻棒轻触实验蟹种不动即判断为死亡。
实验设1个对照组，7个药物剂量组。每个实验剂量组放置雌蟹蟹种和雄蟹蟹种各10只。预实验设8个药物剂量为0，8.0，16.0，20.0，250，32.0，64.0和128.0 mg/L。根据预实验结果，确定实验剂量的上限剂量对数值（Xk）和下限剂量对数值（Xi），依据实验组间距公式d =（Xk-Xi）/（G-1），[d<0.155（0.08～0.10）]，计算实验组药物的对数剂量。
1.2.2实验数据分析实验数据采用SAS/STAT13.1统计软件中概率单位程序（PROBIT Procedure）进行概率回归分析[5]。概率单位程序选择以药物对数剂量[log10（Dose）]作为自变量，死亡概率单位为应变量，利用最大可能率估计法找出回归模型的参数估计值，建立直线回归方程模型：Y = b0 + b1×log10（DOSE）。模型的适合度和概率值的95%置信区间，分别由选项LACKFIT和INVERSRCL定界。最后根据模型估算的概率值与实际估算值进行比较，以PREDPPLOT图表示两者间的吻合程度。
设药物分组标志为A，剂量为DOSE，各次试验的死亡数为R，试验动物数为N，计算药物的半致死剂量（LD50）。
SAS程序：
DATA a；
Input a dose r n；
PROC PROBIT LOG10；
MODEL r/n=dose/LACKFIT INVERSECL；
BY A；
RUN。
2结果
2.1实验药物剂量的确定
实验蟹种平均体重（4.56±0.53） g。24 h对照组死亡率为0。根据7个药物剂量组24 h死亡率，选取16.0，20.0，25.0，29.0和55.0 mg/L为有效实验药物剂量（表1）。
2.2聚维酮碘对中华绒鳌蟹蟹种的急性毒性影响
实验蟹种平均体重（5.95±0.48）g。24 h急性毒性试验对照组和15.85 mg/L药物剂量组死亡数为0。19.50、23.99、29.51和36.31 mg/L药物剂量组死亡数分别为3、7、17和19只。4467 mg/L和54.95 mg/L药物剂量组死亡数均为20只。由此得到，24 h聚维酮碘对中华绒鳌蟹蟹种死亡率分别为0、0.15%、0.35%、085%、0.95%、100.0%、100.0%。48 h对照组和实验组实验蟹种在24 h基础上均无死亡。 3讨论
聚乙烯吡咯烷酮本身没有抗菌作用，与碘络合后碘在表面活性剂中的缓慢释放，不仅增加了碘的溶解度，同时提高了碘溶液的穿透能力，达到持久消毒杀菌作用。聚维酮碘是唯一被中国药典收载的含碘消毒制剂，对大部分细菌，真菌和病毒均有不同的抑菌和杀菌作用[6，7]。根据《化学农药环境安全评价试验准则》（GB/T 31270.12-2014）中农药对鱼类等级划分标准，聚维酮碘为低毒类药物。《危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法》（GB/T 21281-2007）中，聚维酮碘为急性毒性Ⅲ级。聚维酮碘性状稳定，使用简便，杀菌作用持久，刺激性低，不产生二次污染，无残留毒性的特点，在水產经济动物养殖中主要用于鱼卵、苗种和疾病防治的杀菌消毒[8-12]。
急性毒性试验是评价毒物最直接的方法。聚维酮碘对甲壳类养殖动物幼体的毒性研究中，郭永军[13]、熊斌[14]和李飞[15]等分别对凡纳滨对虾仔虾、南美白对虾仔虾和青虾幼虾进行了毒性研究报道。本次实验主要针对中华绒鳌蟹蟹种进行了24 h急性毒性试验，SAS/STAT13.1统计软件分析实验数据，得到直线回归方程：Y=-16104 1 + 11.519 2 log10（Dose）， 24 h半致死剂量（LD50）值为25.00486 mg/L，95%可置信区间为23.313 96～26.806 31 mg/L。实验结果低于与刘庆坤[16]对三疣梭子蟹大眼幼体和Ⅰ仔蟹24 h LD50 36.661 mg/L和35.467 mg/L，盐度是否对聚维酮碘有效碘稳定性产生影响还待进一步进行实验探讨。
实验统计学计算半致死剂量（LD50）的方法很多，如目测法、改良冠氏法、序贯法、概率单位-对数图解法、加权直线回归法（Bliss）法等[17]。Bliss法是毒理学研究中常用的数据分析方法，SAS软件分析系统中可以调用PROBIT过程来实现Bliss法。
本次实验数据采用国际公认的大型集成标准应用软件SAS（statistical analysis system）软件包编写程序[17-18]。数据语言程序建立临时数据集a，输入顺序为药物剂量（does），死亡数（n），实验动物数（r）。调用PROBIT过程，选择LOG10为药物剂量取常用对数。MODEL语句以LACKFIT要求对失似进行检验；INVERSECL求出用原始药物剂量所表达的各种反应剂量。BY语句要求按分组剂量A分别计算。参数的估计通过概率单位（PROBIT Procedure）程序进行概率回归分析，实验数据与函数值间的似合度，以皮尔逊卡方检验（Pearson Chi-Square）和L.R卡方检验（L.R.Chi-Square） 2种方法对曲线失似进行检验分析。检验结果P值均大于0.05，似合优度检验结果支持PROBIT模型。
曲线似合检验采用概率单位法分析，以对数药物剂量作为自变量，死亡概率为应变量，得到直线回归方程。同时进行了参数的假设检验，得到直线回归方程中截距（a），斜率（b）与对数半致死剂量（μ）、标准差（σ）间的关系。PREDPPLOT图选项与ODS图形观察符合正态的公差分布，曲线的似合效果是满意的。
运用SAS软件进行实验数据统计分析，大大简化了繁锁的运算，运算精密度高，使用者只需根据实验数据更改程序的数据部分，结果更加可靠。
参考文献：
[1] 徐庆华.含碘消毒剂及其应用技术[J].中国消毒学杂志，2012，29（4）：316-318
[2] 郎轶咏，王强，刘兰娣.聚维酮碘溶液稳定性的研究[J].中国医院药学杂志，2008，28（17）：1523-1525
[3] 姜山，周大勇，魏淑贞.提高聚维酮碘溶液稳定性的方法[J].中国医院药学杂志，2002，22（3）：189-190
[4] 王武，李应森.河蟹生态养殖[M].北京：中国农业出版社，2010：38-50
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[8] Satyanarayan S，Bejankiwar R S，Chaudhari P R，et al.Impact of some chlorinated pesticides on the haematology of the fish Cypinus carpio and Puntius ticto[J].Journal of Environmental Sciences.2004，16（4）：631-634
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[10] 刘荭，王侃，彭锦新.碘伏对水生动物细菌和真菌病原杀灭效果的研究[J].中国动物检疫，1999，14（4）：7-9
[11] 李清禄，陈强，蔡春标.新型水产养殖消毒剂的制备、性能及其临床应用I.碘伏[J].福建农业大学学报，2000，29（4）：508-513
[12] 黄辨非，阮国良，缪有玲. 2种碘制剂对异育银鲫鱼苗的急性毒性试验[J].长江大学学报（自然版），2005，2（11）：60-63
[13] 郭永军，白东清，董少杰，等.3种药物对凡纳滨对虾仔虾的毒性研究[J].安徽农业科学，2010，38（3）：1297-1299，1302
[14] 熊斌.聚维酮碘和高锰酸钾对南美白对虾仔虾的急性毒性试验[J].河北渔业，2014（4）：8-10
[15] 李飞，郭建林，张宇飞，等.4种常用药物对青虾幼虾的毒性研究[J].生物学杂志，2013，30（6）：62-65
[16] 刘庆坤，姜玉声，丛方虎，等.聚维酮碘对三疣梭子蟹大眼幼体及仔蟹的急性毒性研究[J].水产科学，2011，30（9）：563-567
[17] 高惠璇，李贵斌，耿直，等编译.SAS系统SAS/STAT软件、SAS/BASE软件使用手册[M].北京：中国统计出版社，1997
[18] 金丕焕.医用统计方法[M].上海：上海医科大学出版社，1993