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摘 要 静电纺丝作为一种纳米纤维支架的仿生构建方法，已在软骨组织工程领域中得到越来越多的应用和关注。但是，由于静电纺纳米纤维支架的孔径过小以及无法精确控制支架的形状影响其向临床应用转化。近年来涌现出许多控制纳米纤维支架结构的方法。本文对控制纳米纤维支架结构的方法进行了综述，并对纳米纤维支架在软骨组织工程中应用的主要挑战和前景，提出了看法。
关键词 纳米纤维；静电纺丝；支架结构
中图分类号：TQ340 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2013）15-0005-02
软骨可以认为是一种纤维增强的复合材料，是由两个主要的大分子（Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖），细胞，水和溶解有离子和营养物质的溶质组成。软骨一旦受到损伤很难再生，而自体和异体软骨移植，存在来源有限和免疫排斥等问题。这使软骨组织工程成为治疗骨软骨缺损的希望所在。软骨组织工程包括种子细胞，仿生支架，生长因子和生物反应器。为了满足临床移植的需求，理想的组织工程化软骨应具有可控的尺寸、形状、厚度以及良好生物相容性和生物力学性能。而支架是决定组织工程成败的关键因素之一。支架在软骨组织工程中充当临时的细胞外基质的作用，为细胞提供三维的生长环境，提供力学支撑以保持支架预定的形状，最终使细胞和支架的复合物形成成熟的软骨组织。
由于细胞外基质（ECM）的超细纤维状的多孔形貌对于软骨细胞的基本生理活动有重大的影响，用纳米纤维状的仿生支架取代传统的多孔支架将是一个合理的对ECM结构和形态的仿生。静电纺丝法制备的纳米纤维支架可以从成分和结构上实现对天然细胞外基质的仿生；极高的比表面积和负载生物活性成分的能力，也为活性因子的有效释放提供了理想平台；支架具有高孔隙率和高比表面积的特点，利于细胞的黏附、迁移、生长及分化，因而成为软骨组织工程材料领域的研究热点。
在静电纺丝制备软骨组织工程支架时，主要考虑支架结构的构建。因此，本文对支架结构的研究进展进行综合评述，并指出这些研究的不足及今后的发展方向。
1 软骨组织工程纳米纤维支架的结构
1.1 纳米纤维支架的内部结构
支架的内部结构主要是指孔隙率，孔径，孔的连通性等。在静电纺丝中，从喷丝头喷出的射流存在不稳定鞭动，导致纤维随机地沉积在收集装置上。结果是，收集到的纤维排列非常紧密，无法精确形成合适的孔径使细胞向支架内部生长，无法构建出较厚的组织。如何实现支架同时具备纳米纤维结构和3D大孔是组织工程材料目前需要突破的难题之一。现有的解决方案主要包括四个方面：通过在支架上开孔来扩大孔径，如使用致孔剂，激光和超声等方法增大纳米纤维支架的孔径；通过微、纳米纤维复合的方法增大孔径；通过改变接受装置从而改变原有电场的分布，实现增大孔径的目的。
最近，有些学者通过调整纺丝液的粘弹性，减少或抑制静电纺射流的不稳定鞭甩，使其形成稳定射流。通过X-Y平台，可以很好的控制纤维落点以及最后形成的结构，从而扩大支架的孔径。Dietmar等人通过熔融静电纺丝技术，可以抑制静电纺中的不稳定鞭甩，形成稳定的聚合物（PCL）射流。通过X-Y平台可以比较精确地控制纤维的落点和运动轨迹，从而可以精确调控PCL纤维支架的孔径、孔隙率和孔连通性等结构。如图1所示，其可以制备出具有数个1 mm×1 mm×1 mm的方格的纤维支架，也可以制备出正方形或菱形孔，孔径约为40微米的纤维支架。这项工作无疑拓宽静电纺丝在组织工程中的应用，尽管其制备出的纤维直径相对较粗（10 μm-50 μm）。
此外，在体外构建纳米纤维支架时，也可以通过层层叠加的方法促进细胞长入支架。Gong等人把脱细胞外基质切成薄片，每一片都滴加软骨细胞悬液，构建出圆柱状细胞支架复合物。因其构建方法类似于三明治，也叫“三明治”模式。Xue等人借鉴上述方法，并把它和静电纺纳米纤维膜结合起来。如图2所示，其先在PCL/GT的膜片上滴加软骨细胞悬液；然后在第一片膜片上再放上另一片膜片，再滴加相同浓度的细胞悬液；以此类推，直至叠加到预定的厚度。经过体外和体内的培养可以形成完整、成熟和具有一定厚度（2 mm）的软骨组织。
1.2 纳米纤维支架的外部形状
支架的外部形状主要是指支架的尺寸、形状和厚度。在临床中，对于皮下植入，尤其是用支架修复耳朵或鼻子的软骨缺损时，即使是很轻微地不符合原有形状或形状上的不规则，也会被察觉并对病人的外观形象产生不好的后果。另外，在针对病人的不规则关节软骨缺损时，通常会把其周围正常软骨切掉，形成规则的圆柱体缺损，从而移植相同尺寸的移植物。而对正常软骨的切除，实际上进一步扩大了病人的软骨缺损。综上所述，软骨组织工程支架的外部形状要和软骨缺损处尽可能匹配，以利于修复区和周围正常区的连接以及减少不必要的正常软骨的切除。现在，对于纳米支架的外部宏观形状方面的研究尚处于起步阶段。
Tuan等人先把PLLA纳米纤维支架切成1×1 cm2，再在支架表面接种上MSC细胞。然后把细胞支架复合物移入到其自制的模具中。如图3所示，其自制的模具包括外面两片聚丙烯板，中间夹着硅胶垫圈，其上的两个格子（10×10×2 mm）是用于设定组织工程软骨的厚度和尺寸的。在模具的两端用螺丝固定，聚丙烯板上1 mm的孔径允许营养物质自由通过。为了使细胞和营养物质进入支架内部，把细胞支架复合物放入生物反应器（其搅拌速率为30 rpm）中培养。使用模具，一是为了保护细胞，防止培养液剪切力对细胞的影响；二是为了保持细胞支架复合物的结构，防止其在培养过程中分层。最终，在体外成功制备出长宽高（10×10×2 mm）的正方体的成熟软骨组织。但是，他们只是研究形状软骨的体外构建，没有进一步做体内的实验。
Xue等把聚己内酯/明胶（PCL/GT）的纳米纤维膜片切成圆形、长方形和三角形，和软骨细胞按照上述的“三明治”模式进行层层叠加。经过体外培养4周后，移植入裸鼠皮下培养24周。发现细胞支架复合物可以承受裸鼠皮肤的张力，保持原有形状，并形成成熟的软骨组织（图4）。 Xue等人进一步把裁剪后的PCL/GT膜片贴附在耳状的钛合金模具上，层层叠加构建。体外培养2周后，因细胞支架复合物的力学性能不够，把它与钛合金模具一起移植入裸鼠皮下培养。培养6周后取出，移植支架细胞复合物已经形成成熟的软骨组织。最终，得到与钛合金模具相似度达到91.4%的耳状软骨（图5）。
在耳、鼻软骨缺损修复方面，通过模具可以较精确地塑形。但是纳米支架的力学性能不够，往往需要借助钛合金等模具的支撑，从而带来二次手术的弊端。在关节软骨修复中，还是不能按照缺损软骨的形状和尺寸精确地制备出合适的纳米纤维支架。在临床实践中，大部分病人的关节软骨缺损都是不规则的形状。而现有的方法均是通过对纳米纤维膜片进行裁剪，进而控制构建的软骨的形状。但是通过裁剪只能得到像正方形，三角形和圆形等规则形状，很难得到不规则形状。
在纳米纤维支架应用于软骨组织工程的方面，如何精确地控制纳米纤维支架的形状，进而精确控制构建的软骨形状是现在急需解决的难题之一。通过核磁共振对缺损软骨成像，3D打印技术制备和缺损软骨相似的模具，最后利用图案化静电纺丝技术，也许可以制备出和缺损软骨形状相似的纳米纤维支架。
2 总结和展望
在软骨组织工程的支架方面，急需解决的问题有：如何使支架同时具有良好的生物相容性和力学性能；如何使支架同时具有纳米纤维结构和大孔形貌；如何按照缺损软骨的形状和尺寸制备出合适的纳米纤维支架，进而制备出形状合适的工程化软骨；如何改善工程化软骨的力学性能，使其接近或达到天然软骨的力学性能。
随着软骨缺损修复和再生机制研究的深入和各种新技术的涌现，软骨再生领域在未来的十年中也许会发生革命性的变化。最终，根据软骨缺损的大小、部位和性质的不同，可以制备出合适的软骨组织工程支架，并结合上种子细胞和复合生长因子或抗炎症因子等，实现软骨缺损部位的再生。
注：本文第二作者贡献等同于第一作者。
参考文献
[1]Brown， T.D.， P.D. Dalton， and D.W. Hutmacher， Direct Writing By Way of Melt Electrospinning. Advanced Materials， 2011. 23（47）： p. 5651.
[2]Gong， Y.Y.， et al.， A sandwich model for engineering cartilage with acellular cartilage sheets and chondrocytes. Biomaterials， 2011. 32（9）： p. 2265-2273.
[3]Xue， J.， et al.， Engineering ear-shaped cartilage using electrospun fibrous membranes of gelatin/polycaprolactone. Biomaterials， 2013.
4]Janjanin， S.， et al.， Mold-shaped， nanofiber scaffold-based cartilage engineering using human mesenchymal stem cells and bioreactor. Journal of Surgical Research， 2008. 149（1）： p. 47-56.
关键词 纳米纤维；静电纺丝；支架结构
中图分类号：TQ340 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2013）15-0005-02
软骨可以认为是一种纤维增强的复合材料，是由两个主要的大分子（Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖），细胞，水和溶解有离子和营养物质的溶质组成。软骨一旦受到损伤很难再生，而自体和异体软骨移植，存在来源有限和免疫排斥等问题。这使软骨组织工程成为治疗骨软骨缺损的希望所在。软骨组织工程包括种子细胞，仿生支架，生长因子和生物反应器。为了满足临床移植的需求，理想的组织工程化软骨应具有可控的尺寸、形状、厚度以及良好生物相容性和生物力学性能。而支架是决定组织工程成败的关键因素之一。支架在软骨组织工程中充当临时的细胞外基质的作用，为细胞提供三维的生长环境，提供力学支撑以保持支架预定的形状，最终使细胞和支架的复合物形成成熟的软骨组织。
由于细胞外基质（ECM）的超细纤维状的多孔形貌对于软骨细胞的基本生理活动有重大的影响，用纳米纤维状的仿生支架取代传统的多孔支架将是一个合理的对ECM结构和形态的仿生。静电纺丝法制备的纳米纤维支架可以从成分和结构上实现对天然细胞外基质的仿生；极高的比表面积和负载生物活性成分的能力，也为活性因子的有效释放提供了理想平台；支架具有高孔隙率和高比表面积的特点，利于细胞的黏附、迁移、生长及分化，因而成为软骨组织工程材料领域的研究热点。
在静电纺丝制备软骨组织工程支架时，主要考虑支架结构的构建。因此，本文对支架结构的研究进展进行综合评述，并指出这些研究的不足及今后的发展方向。
1 软骨组织工程纳米纤维支架的结构
1.1 纳米纤维支架的内部结构
支架的内部结构主要是指孔隙率，孔径，孔的连通性等。在静电纺丝中，从喷丝头喷出的射流存在不稳定鞭动，导致纤维随机地沉积在收集装置上。结果是，收集到的纤维排列非常紧密，无法精确形成合适的孔径使细胞向支架内部生长，无法构建出较厚的组织。如何实现支架同时具备纳米纤维结构和3D大孔是组织工程材料目前需要突破的难题之一。现有的解决方案主要包括四个方面：通过在支架上开孔来扩大孔径，如使用致孔剂，激光和超声等方法增大纳米纤维支架的孔径；通过微、纳米纤维复合的方法增大孔径；通过改变接受装置从而改变原有电场的分布，实现增大孔径的目的。
最近，有些学者通过调整纺丝液的粘弹性，减少或抑制静电纺射流的不稳定鞭甩，使其形成稳定射流。通过X-Y平台，可以很好的控制纤维落点以及最后形成的结构，从而扩大支架的孔径。Dietmar等人通过熔融静电纺丝技术，可以抑制静电纺中的不稳定鞭甩，形成稳定的聚合物（PCL）射流。通过X-Y平台可以比较精确地控制纤维的落点和运动轨迹，从而可以精确调控PCL纤维支架的孔径、孔隙率和孔连通性等结构。如图1所示，其可以制备出具有数个1 mm×1 mm×1 mm的方格的纤维支架，也可以制备出正方形或菱形孔，孔径约为40微米的纤维支架。这项工作无疑拓宽静电纺丝在组织工程中的应用，尽管其制备出的纤维直径相对较粗（10 μm-50 μm）。
此外，在体外构建纳米纤维支架时，也可以通过层层叠加的方法促进细胞长入支架。Gong等人把脱细胞外基质切成薄片，每一片都滴加软骨细胞悬液，构建出圆柱状细胞支架复合物。因其构建方法类似于三明治，也叫“三明治”模式。Xue等人借鉴上述方法，并把它和静电纺纳米纤维膜结合起来。如图2所示，其先在PCL/GT的膜片上滴加软骨细胞悬液；然后在第一片膜片上再放上另一片膜片，再滴加相同浓度的细胞悬液；以此类推，直至叠加到预定的厚度。经过体外和体内的培养可以形成完整、成熟和具有一定厚度（2 mm）的软骨组织。
1.2 纳米纤维支架的外部形状
支架的外部形状主要是指支架的尺寸、形状和厚度。在临床中，对于皮下植入，尤其是用支架修复耳朵或鼻子的软骨缺损时，即使是很轻微地不符合原有形状或形状上的不规则，也会被察觉并对病人的外观形象产生不好的后果。另外，在针对病人的不规则关节软骨缺损时，通常会把其周围正常软骨切掉，形成规则的圆柱体缺损，从而移植相同尺寸的移植物。而对正常软骨的切除，实际上进一步扩大了病人的软骨缺损。综上所述，软骨组织工程支架的外部形状要和软骨缺损处尽可能匹配，以利于修复区和周围正常区的连接以及减少不必要的正常软骨的切除。现在，对于纳米支架的外部宏观形状方面的研究尚处于起步阶段。
Tuan等人先把PLLA纳米纤维支架切成1×1 cm2，再在支架表面接种上MSC细胞。然后把细胞支架复合物移入到其自制的模具中。如图3所示，其自制的模具包括外面两片聚丙烯板，中间夹着硅胶垫圈，其上的两个格子（10×10×2 mm）是用于设定组织工程软骨的厚度和尺寸的。在模具的两端用螺丝固定，聚丙烯板上1 mm的孔径允许营养物质自由通过。为了使细胞和营养物质进入支架内部，把细胞支架复合物放入生物反应器（其搅拌速率为30 rpm）中培养。使用模具，一是为了保护细胞，防止培养液剪切力对细胞的影响；二是为了保持细胞支架复合物的结构，防止其在培养过程中分层。最终，在体外成功制备出长宽高（10×10×2 mm）的正方体的成熟软骨组织。但是，他们只是研究形状软骨的体外构建，没有进一步做体内的实验。
Xue等把聚己内酯/明胶（PCL/GT）的纳米纤维膜片切成圆形、长方形和三角形，和软骨细胞按照上述的“三明治”模式进行层层叠加。经过体外培养4周后，移植入裸鼠皮下培养24周。发现细胞支架复合物可以承受裸鼠皮肤的张力，保持原有形状，并形成成熟的软骨组织（图4）。 Xue等人进一步把裁剪后的PCL/GT膜片贴附在耳状的钛合金模具上，层层叠加构建。体外培养2周后，因细胞支架复合物的力学性能不够，把它与钛合金模具一起移植入裸鼠皮下培养。培养6周后取出，移植支架细胞复合物已经形成成熟的软骨组织。最终，得到与钛合金模具相似度达到91.4%的耳状软骨（图5）。
在耳、鼻软骨缺损修复方面，通过模具可以较精确地塑形。但是纳米支架的力学性能不够，往往需要借助钛合金等模具的支撑，从而带来二次手术的弊端。在关节软骨修复中，还是不能按照缺损软骨的形状和尺寸精确地制备出合适的纳米纤维支架。在临床实践中，大部分病人的关节软骨缺损都是不规则的形状。而现有的方法均是通过对纳米纤维膜片进行裁剪，进而控制构建的软骨的形状。但是通过裁剪只能得到像正方形，三角形和圆形等规则形状，很难得到不规则形状。
在纳米纤维支架应用于软骨组织工程的方面，如何精确地控制纳米纤维支架的形状，进而精确控制构建的软骨形状是现在急需解决的难题之一。通过核磁共振对缺损软骨成像，3D打印技术制备和缺损软骨相似的模具，最后利用图案化静电纺丝技术，也许可以制备出和缺损软骨形状相似的纳米纤维支架。
2 总结和展望
在软骨组织工程的支架方面，急需解决的问题有：如何使支架同时具有良好的生物相容性和力学性能；如何使支架同时具有纳米纤维结构和大孔形貌；如何按照缺损软骨的形状和尺寸制备出合适的纳米纤维支架，进而制备出形状合适的工程化软骨；如何改善工程化软骨的力学性能，使其接近或达到天然软骨的力学性能。
随着软骨缺损修复和再生机制研究的深入和各种新技术的涌现，软骨再生领域在未来的十年中也许会发生革命性的变化。最终，根据软骨缺损的大小、部位和性质的不同，可以制备出合适的软骨组织工程支架，并结合上种子细胞和复合生长因子或抗炎症因子等，实现软骨缺损部位的再生。
注：本文第二作者贡献等同于第一作者。
参考文献
[1]Brown， T.D.， P.D. Dalton， and D.W. Hutmacher， Direct Writing By Way of Melt Electrospinning. Advanced Materials， 2011. 23（47）： p. 5651.
[2]Gong， Y.Y.， et al.， A sandwich model for engineering cartilage with acellular cartilage sheets and chondrocytes. Biomaterials， 2011. 32（9）： p. 2265-2273.
[3]Xue， J.， et al.， Engineering ear-shaped cartilage using electrospun fibrous membranes of gelatin/polycaprolactone. Biomaterials， 2013.
4]Janjanin， S.， et al.， Mold-shaped， nanofiber scaffold-based cartilage engineering using human mesenchymal stem cells and bioreactor. Journal of Surgical Research， 2008. 149（1）： p. 47-56.