【摘 要】
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目的 构建鼠疫耶尔森氏杆菌减毒疫苗株鼠毒素基因缺失的突变菌株,建立鼠疫耶尔森氏杆菌的基因敲除方法,为研究鼠疫耶尔森氏杆菌基因奠定基础. 方法 选择1株鼠疫耶尔森氏杆菌
【机 构】
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青海省地方病预防控制所,青海省鼠疫防控与研究重点实验室,青海西宁811602
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目的 构建鼠疫耶尔森氏杆菌减毒疫苗株鼠毒素基因缺失的突变菌株,建立鼠疫耶尔森氏杆菌的基因敲除方法,为研究鼠疫耶尔森氏杆菌基因奠定基础. 方法 选择1株鼠疫耶尔森氏杆菌减毒疫苗株(菌株号为0614F)为实验菌株.利用Artemis软件阅读鼠疫菌91001株基因序列,查找并导出鼠毒素(Ymt)及其两侧100个基因序列.设计同源区突变盒引物和鉴定引物,采用λ-Red系统一步法敲除0614F鼠毒素编码基因并进行鉴定. 结果 质粒提取试剂盒提取Escherichia coli DH5α培养物pKD46质粒50μl,浓度为121.1 ng/μl;同源区突变盒引物扩增含有氯霉素抗性基因菌株DNA,PCR产物进行1％琼脂糖电泳凝胶电泳鉴定后切胶,用胶回收试剂盒提取氯霉素线性突变盒50μl,浓度为724 ng/μl;0614F菌株经两次电转化获得具有氨苄青霉素和氯霉素抗性的菌株,用相应鉴定引物进行PCR鉴定,获得菌株鉴定为鼠毒素基因缺失株0614F-△Ymt. 结论 应用基因敲除技术对鼠疫耶尔森氏杆菌鼠毒素基因定向突变成功,为青藏高原型鼠疫菌株新型疫苗研究奠定了实验基础.
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