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摘要
[目的] 优化正己烷萃取小球藻油的试验条件。[方法] 采用正已烷萃取小球藻油脂，进行三因素三水平正交试验考察最佳提取条件。 [结果] 萃取温度对萃取结果影响最大，最佳萃取温度以60 ℃为宜，萃取剂/藻干重以4 ml/g为宜，而最佳萃取时间为60 min。[结论] 该研究可为小球藻油的生物柴油方向利用提供基础。
关键词小球藻；萃取；正己烷
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2015）05-206-02
基金项目“十二五”农村领域国家科技计划课题（2011BAD14B05）。
作者简介金洪波（1975- ），男，河南南阳人，工程师，从事生物质能源研究。
收稿日期2014-12-29
生物柴油是一种优质清洁柴油，可以从各种生物质中提炼，可以说是取之不尽、用之不竭的能源。生物柴油更以其环保、安全、可降解、可再生以及优良的燃烧性能等优点，在资源日益枯竭的今天，在能源领域拥有重要的地位和广阔的发展前景，有望取代石油成为替代燃料。在2014年APEC会议期间，中美签署了关于气候和环境保护的合作协议，许多专家都预计我国会陆续出台支持生物质能源的具体政策，以及加大对违反环保法规的处罚力度。
小球藻发酵生产生物柴油，是柴油生产的一条比较具有优势的技术途径，河南天冠集团技术中心使用发酵法生产异养小球藻[1-3]，胞内油脂质含量在50%左右，且质量较好；制备出来的生物柴油含硫量低，同时该中心实验室在后提取工序上也不使用硫酸，避免硫的增加，提取出来的生物柴油使用后二氧化硫和硫化物的排放大大减少；具有良好的生物降解性，在环境中容易被微生物分解利用。發酵法生产生物柴油具有非常好的可再生性，也更符合国家的“不能与粮争地”，“不能与人争粮”，“不能与人争油”，“不能污染环境”的“四不”的关于生物柴油的国家政策。因此小球藻发酵法生产生物柴油具有广阔的发展前景。
发酵法生产的小球藻发酵液，在后处理提油工序中，萃取是关键的一步，在很大程度上影响着油质的得率。在萃取过程中，温度低不利于油质溶于萃取剂中，但温度太高又会增大萃取剂的挥发性；萃取剂用量少会造成油提取不充分，但用量太多又会造成损耗太多。因此，该试验以正己烷为萃取剂，从萃取温度、萃取剂与干物质比值，萃取时间长短三因素，以及每个因素选取的3个水平的正交试验来确定正己烷在小球藻酯化液中萃取的最佳条件。
1材料与方法
1.1试验材料
小球藻细胞破碎液为河南天冠集团技术中心50 L罐小球藻发酵液经高压均质机在100 MPa条件下破碎3次后所得，细胞破碎率为85%；
正己烷为分析级正己烷液体。
脂肪测定仪为上海乔跃电子有限公司JOYN-SXT-04型号脂肪测定仪；
高速离心机为长沙英泰仪器有限公司 G12台式大容量冷冻离心机；
旋转蒸发仪为BUCHI R-200 Rotavapor。
其他材料：0.001级电子称一台，100 ml量筒1支，250 ml量筒1支，500 ml量筒1支，500 ml分液漏斗3支。
1.2试验方法
1.2.1萃取。每次取100 ml小球藻细胞破碎液按以下根据因素水平表设定的正交试验表来进行试验，所取小球藻细胞破碎液的干物质含量为53.63 g/L。
1.2.2离心。按正交试验表所做的9次试验，每次萃取后的混合液用高速离心机6 000 r/min离心10 min。离心2次。
1.2.3静置分层。离心2次的上层混合液倒入500 ml分液漏斗中静置15 min分层。
1.2.4蒸馏。将静置分层后的油相用旋转蒸发仪蒸馏出小球藻油和回收正己烷。旋转蒸发仪蒸馏时温度为85 ℃，压力为-30×10-4 MPa。
2结果与分析
使用SPSS18.0对温度（40 ℃、60 ℃、80 ℃）、萃取剂添加量（2 ml/g、3 ml/g、4 ml/g）、萃取时间（30 min、60 min、90 min）进行3因素3水平正交试验设计（表1）。
由表2可以看出，温度为60 ℃、萃取剂/藻干重为4 ml/g、萃取时间60 min时，萃取后获得的油脂量最高，达到4.74 g。说明该条件为最佳萃取条件。
由表3可以看出，因素时间的均方、F值均比较高，说明其对整个结果的影响最大。而添加量的均方和F值均比较低，说明其对整个结果的影响最小。最终分析得出，数据间显著性分析R2>95%，说明结果差异比较显著。通过对参数进行估计，结果表明各参数均在95%置信区间内，数据可靠。
3结论
研究结果表明，试验的3因素中，影响最大的温度因素以60 ℃合适，影响其次的时间因素以60 min为宜，影响最小的萃取剂与干物质比值为4 ml/g最好，其影响最小说明萃取剂用量还可以增加。
参考文献
[1] 毕生雷，张成明，李十中，等.异养小球藻半连续发酵生产油脂工艺探讨[J].食品与发酵科技，2014（5）：36-40.
[2] 郑世文，赵玉峰，毕生雷.不同型号酵母浸粉及补糖对异养微藻生长的影响[J].现代农业科技，2014（8）：178-179.
[3] 毕生雷，乔建援，刘钺，等.异养小球藻用发酵罐的使用与维护[J].化学工程与装备，2014（7）：64-65.
[4] 景建克，许倩倩，刘硕，等.大规模异养发酵培养小球藻USTB-01研究[J].现代化工，2008，28（12）：67-70.
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[7] CHEN Y H，WALKER T H.Fed-batch fermentation and supercritical fluid extraction of heterotrophic microalgal Chlorella protothecoides lipids[J].Bioresource Technology，2012，114（1）：512-517.
[8] MUGE ISLETEN-HOSOGLU，IDIL GULTEPE，MURAT ELIBOL.Optimization of carbon and nitrogen sources for biomass and lipid production by Chlorella saccharophila under heterotrophic conditions and development of Nile red fluorescence based method for quantification of its neutral lipid content[J].Biochemical Engineering Journal，2012，61：11-19.
[9] 李興武，李元广，钱峰慧，等.小球藻异养–光自养串联培养技术及其放大研究[C]//全国海洋生物技术与海洋药物学术会议集.大连，2006：2-6.
[10] 毕生雷，杜风光，孙沛勇，等.异养小球藻的半连续发酵方法：中国：CN201310031846.7[P].2013-04-24.
[11] 钱文倩.微生物对异养小球藻生长及代谢产物影响的研究[D].上海：上海交通大学，2008：2-10.
[12] 梁世中，朱明军，孟海华，等.发酵罐葡萄糖流加大规模异养培养小球藻[J].华南理工大学学报：自然科学版，2000，28（12）：66-70.
责任编辑黄小燕责任校对李岩
[目的] 优化正己烷萃取小球藻油的试验条件。[方法] 采用正已烷萃取小球藻油脂，进行三因素三水平正交试验考察最佳提取条件。 [结果] 萃取温度对萃取结果影响最大，最佳萃取温度以60 ℃为宜，萃取剂/藻干重以4 ml/g为宜，而最佳萃取时间为60 min。[结论] 该研究可为小球藻油的生物柴油方向利用提供基础。
关键词小球藻；萃取；正己烷
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2015）05-206-02
基金项目“十二五”农村领域国家科技计划课题（2011BAD14B05）。
作者简介金洪波（1975- ），男，河南南阳人，工程师，从事生物质能源研究。
收稿日期2014-12-29
生物柴油是一种优质清洁柴油，可以从各种生物质中提炼，可以说是取之不尽、用之不竭的能源。生物柴油更以其环保、安全、可降解、可再生以及优良的燃烧性能等优点，在资源日益枯竭的今天，在能源领域拥有重要的地位和广阔的发展前景，有望取代石油成为替代燃料。在2014年APEC会议期间，中美签署了关于气候和环境保护的合作协议，许多专家都预计我国会陆续出台支持生物质能源的具体政策，以及加大对违反环保法规的处罚力度。
小球藻发酵生产生物柴油，是柴油生产的一条比较具有优势的技术途径，河南天冠集团技术中心使用发酵法生产异养小球藻[1-3]，胞内油脂质含量在50%左右，且质量较好；制备出来的生物柴油含硫量低，同时该中心实验室在后提取工序上也不使用硫酸，避免硫的增加，提取出来的生物柴油使用后二氧化硫和硫化物的排放大大减少；具有良好的生物降解性，在环境中容易被微生物分解利用。發酵法生产生物柴油具有非常好的可再生性，也更符合国家的“不能与粮争地”，“不能与人争粮”，“不能与人争油”，“不能污染环境”的“四不”的关于生物柴油的国家政策。因此小球藻发酵法生产生物柴油具有广阔的发展前景。
发酵法生产的小球藻发酵液，在后处理提油工序中，萃取是关键的一步，在很大程度上影响着油质的得率。在萃取过程中，温度低不利于油质溶于萃取剂中，但温度太高又会增大萃取剂的挥发性；萃取剂用量少会造成油提取不充分，但用量太多又会造成损耗太多。因此，该试验以正己烷为萃取剂，从萃取温度、萃取剂与干物质比值，萃取时间长短三因素，以及每个因素选取的3个水平的正交试验来确定正己烷在小球藻酯化液中萃取的最佳条件。
1材料与方法
1.1试验材料
小球藻细胞破碎液为河南天冠集团技术中心50 L罐小球藻发酵液经高压均质机在100 MPa条件下破碎3次后所得，细胞破碎率为85%；
正己烷为分析级正己烷液体。
脂肪测定仪为上海乔跃电子有限公司JOYN-SXT-04型号脂肪测定仪；
高速离心机为长沙英泰仪器有限公司 G12台式大容量冷冻离心机；
旋转蒸发仪为BUCHI R-200 Rotavapor。
其他材料：0.001级电子称一台，100 ml量筒1支，250 ml量筒1支，500 ml量筒1支，500 ml分液漏斗3支。
1.2试验方法
1.2.1萃取。每次取100 ml小球藻细胞破碎液按以下根据因素水平表设定的正交试验表来进行试验，所取小球藻细胞破碎液的干物质含量为53.63 g/L。
1.2.2离心。按正交试验表所做的9次试验，每次萃取后的混合液用高速离心机6 000 r/min离心10 min。离心2次。
1.2.3静置分层。离心2次的上层混合液倒入500 ml分液漏斗中静置15 min分层。
1.2.4蒸馏。将静置分层后的油相用旋转蒸发仪蒸馏出小球藻油和回收正己烷。旋转蒸发仪蒸馏时温度为85 ℃，压力为-30×10-4 MPa。
2结果与分析
使用SPSS18.0对温度（40 ℃、60 ℃、80 ℃）、萃取剂添加量（2 ml/g、3 ml/g、4 ml/g）、萃取时间（30 min、60 min、90 min）进行3因素3水平正交试验设计（表1）。
由表2可以看出，温度为60 ℃、萃取剂/藻干重为4 ml/g、萃取时间60 min时，萃取后获得的油脂量最高，达到4.74 g。说明该条件为最佳萃取条件。
由表3可以看出，因素时间的均方、F值均比较高，说明其对整个结果的影响最大。而添加量的均方和F值均比较低，说明其对整个结果的影响最小。最终分析得出，数据间显著性分析R2>95%，说明结果差异比较显著。通过对参数进行估计，结果表明各参数均在95%置信区间内，数据可靠。
3结论
研究结果表明，试验的3因素中，影响最大的温度因素以60 ℃合适，影响其次的时间因素以60 min为宜，影响最小的萃取剂与干物质比值为4 ml/g最好，其影响最小说明萃取剂用量还可以增加。
参考文献
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[7] CHEN Y H，WALKER T H.Fed-batch fermentation and supercritical fluid extraction of heterotrophic microalgal Chlorella protothecoides lipids[J].Bioresource Technology，2012，114（1）：512-517.
[8] MUGE ISLETEN-HOSOGLU，IDIL GULTEPE，MURAT ELIBOL.Optimization of carbon and nitrogen sources for biomass and lipid production by Chlorella saccharophila under heterotrophic conditions and development of Nile red fluorescence based method for quantification of its neutral lipid content[J].Biochemical Engineering Journal，2012，61：11-19.
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[10] 毕生雷，杜风光，孙沛勇，等.异养小球藻的半连续发酵方法：中国：CN201310031846.7[P].2013-04-24.
[11] 钱文倩.微生物对异养小球藻生长及代谢产物影响的研究[D].上海：上海交通大学，2008：2-10.
[12] 梁世中，朱明军，孟海华，等.发酵罐葡萄糖流加大规模异养培养小球藻[J].华南理工大学学报：自然科学版，2000，28（12）：66-70.
责任编辑黄小燕责任校对李岩