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摘 要 前期研究表明，茄子Enhanced disease susceptibility 1（SmEDS1）正调控茄子青枯病抗性，但是其抗病机理有待进一步研究。为筛选SmEDS1的互作蛋白，本研究构建pGBK7-SmEDS1诱饵载体，并利用酵母双杂交技术对相应的均一化cDNA酵母文库进行筛选。从2次独立的实验中筛选到9个克隆，其非冗余地编码6种蛋白，即TCP转录因子、DNAJ分子伴侣、SnRK1蛋白α亚基、氰酸酯酶、CIP4蛋白和1个未知蛋白。基于这些蛋白的功能，推测SmEDS1可能通过与本研究筛选到TCP转录因子互作调控水杨酸的合成，进而调控茄子的青枯病抗性。
关键词 茄子；EDS1；互作蛋白；青枯病
中图分类号 S436.411 文献标识码 A
Abstract In our previous study， EDS1 of eggplant （SmEDS1） was found positively regulating the bacterial wilt resistance， but the resistance mechanism was not known. To screen the candidate interactors of SmEDS1， the bait protein vector of pGBK7-SmEDS1 was construct to screen the cDNA library by Y2H. The result showed that total nine clones were obtained by two independent experiments. The nine clones encode six proteins including TCP transcriptional factor， DNAJ molecular chaperone， cyanate hydratase， CONSTANS interacting protein 4 and an unknown protein. Based on the known function of the candidate protein， SmEDS1 interacted with the TCP， which regulating the synthesis of salicylic acid and finally regulating the bacterial resistance.
Keywords eggplant； EDS1； interacted protein； bacterial wilt
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.016
EDS1广泛存在于植物中，已从多种植物中如拟南芥、水稻、大豆、葡萄等得到克隆[1]。已有的研究表明，EDS1具有保守的结构域，其蛋白结构可以明显的分为N段的LP结构域和C段的EP结构域，并且LP和EP结构域在EDS1与PAD4、SAG101等互作过程中发挥着重要的作用[1]。
EDS1在植物的抗病过程中发挥着重要的作用，是水杨酸抗病途径中的重要因子，其能调控水杨酸合成基因ICS1和水杨酸下游信号基因的表达[2]。在已有的模型中，EDS1处于水杨酸合成的上游，然而其调控水杨酸合成机理尚不清晰[3]。在EDS1介导的抗病防卫反应中，EDS1主要通过与其他蛋白的互作来调控植物的抗病性。PAD4
是第一个被鉴定出与EDS1存在互作的蛋白[4]。EDS1通过与PAD4的互作激发植物的HR反应进而限制病原菌的繁殖[4-5]，并且越来越多的实验证明，EDS1抗病功能的发挥必须要PAD4的参与[6-7]。同时EDS1还能够与家族内另一成员SAG101产生互作[1]，并且能够形成EDS1-PAD4- SAG101三复合体[5]。PAD4、SAG101与EDS1的互作功能之一是通过调节EDS1在细胞核和细胞质中的分布平衡激活抗病相关基因的表达/生理过程[5]。除了能与PAD4、SAG101互作外，EDS1能够与Avr直接互作，如AvrRps4、HoPA1[8-9]或者直接与RPS4、RPS6、SNC1等R蛋白互作，接受来自R蛋白的信號激活下游的抗病反应[8-9]。
在前期研究中，我们克隆了茄子的SmEDS1，并且通过VIGS技术证明其正调控茄子的青枯病抗性[10]，然而其抗病机理未知。因此，本研究通过构建pGBK7-SmEDS1诱饵载体，筛选我们前期构建的感染青枯病病原菌R. solanacearum的茄子酵母双杂交文库[11]，以期获得与SmEDS1互作的蛋白，为解析SmEDS1抗青枯病机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究使用Clotech公司的酵母双杂交系统。诱饵载体为pGBK7载体。酵母双杂交文库为我们前期构建的感染青枯病病原菌R. solanacearum的茄子酵母双杂交文库[11]。
1.2 方法
1.2.1 pGBK7-SmEDS1诱饵载体的构建 根据SmEDS1的cDNA序列[10]分别在其两端添加Sfi I的酶切位点序列设计引物，用于扩增SmEDS1基因的cDNA片段，引物序列如下：SmEDS1-F：aaGGCC??ATTAC GGCCATGGTGAGAATAGGAG?AGGGTA；SmEDS1-R：ccGGCCGAGGCGGCC-CTAAATATTAATTCGCCCCGA。以cDNA为模板，利用全式金TransStart FastPfu DNA Polymerase克隆目的片段，并将其纯化回收。将目的片段和pGBK7载体利用Sfi I（Fermentas 公司）酶切，然后切胶回收。将回收的目的片段和载体利用DNA Ligation Kit（TOYOBO公司）进行连接，然后用热激法转化大肠杆菌，过夜培养。随机挑取5个大肠杆菌转化子进行PCR检测，并对扩增得到阳性条带的克隆进行质粒抽提和测序。插入片段测序结果经比对确认正确后，进行后续实验。 1.2.2 pGBK7-SmEDS1自激活检测 pGBK7- SmEDS1自激活检测参考Clotech的操作手册。将载体按照表1的组合导入酵母AH109菌株中，进行自激活检测。
1.2.3 文库筛选 文库筛选参考Clotech的操作手册。
1.2.4 互作蛋白生物信息学分析 将得到的克隆提取质粒、测序。并将得到的数据在茄子基因数据库（http：//eggplant. kazusa.or.jp/index.html）和NCBI数据库中进行比对分析。
2 结果与分析
2.1 pGBK7-SmEDS1诱饵载体的构建
PCR产物经过电泳检测得到约2 000 bp大小的片段（图1）。将PCR产物直接进行测序分析，确认该片段为目的片段。将经过过夜培养的菌落，
随机挑选5个进行PCR检测。结果表明，5个菌落均有约2 000 bp大小的片段（图2），为进一步确认载体是否构建成功，挑取1号菌液提取质粒进行测序分析，测序结果表明pGBK7-SmEDS1诱饵载体构建成功。
2.2 pGBK7-SmEDS1无自激活作用
pGBK7-SmEDS1，pGADT7-LargeT/pGBKT7- p53 和pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC在SD-TL缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照（pGA- DT7-largeT+pGBKT7-p53）可在SD-TLHA缺陷平板生长（图3）。pGBKT7-SmEDS1+pGADT7转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生长，生长状态同阴性对照，LacZ检测结果也与阴性对照相同。因此，研究结果表明pGBK7-SmEDS1无自激活作用。
2.3 互作蛋白分析
本研究第一次文库筛选得到的5个初始阳性克隆中1、3和4号菌落能通过ADE2和HIS3报告基因的检测，而2和5号菌落未能通过ADE2和HIS3报告基因检测。而在第二次文库筛选中得到了13个初始阳性克隆，12、13、15、16、17和18共6个菌落通过了ADE2和HIS3报告基因的检测（图4）。因此在本研究中，共得到了与SmEDS1互作的9个克隆。将9个克隆提取质粒，进行测序比对分析，共编码6种蛋白（表2）。4、12和13号克隆分别各编码一种蛋白，而1和3、15和18、16和17分别编码一种蛋白。
3 讨论
SmEDS1在茄子青枯病抗性中发挥着重要的作用。茄子感抗材料接种青枯病病原菌R.solanac-earum后，SmEDS1的表达量均上升，且其在抗病材料的表达量高于感病材料[12]。进一步的研究表明，SmEDS1正调控茄子青枯病抗性，并且能够影响水杨酸途径中的其他信号基因的表达[10]。为进一步研究其抗病机理，本研究利用酵母双杂交手段筛选到6个与其互作的蛋白。
TCP是植物特有的转录因子，其在植物的抗病过程中发挥着重要的作用，其通过调控植物激素的合成来调控植物的抗病反应。Aster Yellows分泌的SAP11能够与AtTCP1和AtTCP2发生互作，并且降低AtTCP2、AtTCP4、AtTCP13、AtTCP3、AtTCP5、AtTCP10、AtTCP17和AtTCP24等8个基因的表达量，从而降低LOX2基因表达，最终抑制内源JA的合成[13]，降低植物的抗病反应。在AtTCP8与SA合成基因ICS1的启动子直接结合，促进内源SA的合成，正调控拟南芥的抗性[14]。进一步的研究表明，AtTCP8能与WRKY，NAC等转录因子互作，形成复合体与ICS1的启动子结合，调控其表达[14]。其中WRKY正调控ICS1的表达，而NAC抑制ICS1的表达[15] 。因此，在不同的条件下，TCPs与不同的转录因子结合，调控ICS1的表达，最终促进或者抑制SA的合成。因此，我们推断SmEDS1可能是通过与SmTCP互作调控水杨酸的合成，进而调控茄子的青枯病抗性。
DNAJ是广泛存在于植物细胞内的一种分子伴侣，胁迫条件下它能够保护细胞内蛋白质等结构的稳定性。李广存等[16]从富集青枯病抗性相關基因的cDNA文库中筛选到了DNAJ同源蛋白，并且证明该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节，可能在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使胁迫损害细胞恢复活性的功能。在茄子受到R.solanacearum胁迫后，SmEDS1可能通过与DNAJ互作来保持蛋白质的活性，进而激发抗病反应。
SnRK1通常是由具催化功能的α亚基、起调节作用的β亚基以及有活化功能的γ亚基组成的多聚体蛋白激酶[17]，在逆境条件下通过调节能量和胁迫信号响应生物与非生物胁迫[18]。SnRKs能通过活性氧以及水杨酸信号途径调控植物对生物胁迫的防卫反应[18]。已有的报道证明EDS1除了参与水杨酸抗病信号途径外，还参与活性氧的抗病途径[19]。本课题组的前期研究也证明了早期活性氧的迸发正调控茄子的青枯病抗性[20]。SmEDS与alpha subunit of SnRK1的互作是否参与了这个过程有待进一步的研究。
基于上述讨论，SmEDS1可能通过与本研究筛选的TCP的互作调控水杨酸的合成，进而调控茄子的青枯病抗性。而SmDNAJ可能有助于保持SmEDS1的活性，SmSnRK1可能调控SmEDS1介导的水杨酸途径和活性氧途径的平衡。
参考文献
[1] Wagner S， Stuttmann J， Rietz S， et al. Structural basis for signaling by exclusive EDS1 heteromeric complexes with SAG101 or PAD4 in plant innate immunity[J]. Cell Host & Microbe， 2013， 14（6）： 619-630. [2] Cui H， Gobbato E， Kracher B， et al. A core function of EDS1 with PAD4 is to protect the salicylic acid defense sector in Arabidopsis immunity[J]. New Phytologist， 2017， 213（4）： 1 802-1 817.
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[7] Kohorn B D， Kohorn S L， Saba N J， et al. Requirement for pectin methyl esterase and preference for fragmented over native pectins for wall-associated kinase-activated， EDS1/PAD4-dependent stress response in Arabidopsis[J]. Journal of Biological Chemistry， 2014， 289（27）： 18 978-18 986.
[8] Bhattacharjee S， Halane M K， Kim S H， et al. Pathogen effectors target Arabidopsis EDS1 and alter its interactions with immune regulators[J]. Science， 2011， 334（6 061）： 1 405-1 408.
[9] Heidrich K， Wirthmueller L， Tasset C， et al. Arabidopsis EDS1 Connects Pathogen Effector Recognition to Cell Compartment-Specific Immune Responses[J]. Science， 2011， 334（6 061）： 1 401-1 404.
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[13] Sugi A， Kingdom H N， MacLean A M， et al. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis[J]. PNAS， 2011， 108（48）： E1254-E1263.
[14] Wang X， Gao， J， Zhu Z， et al. TCP transcription factors are critical for the coordinated regulation of isochorismate synthase 1 expression in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal， 2015， 82（1）： 151-162.
[15] Zheng X Y， Spivey N W， Zeng W， et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation[J]. Cell Host & Microbe， 2012， 11（6）： 587-596.
[16] 李广存， 金黎平， 王晓武， 等. cDNA文库与RACE方法结合克隆马铃薯DnaJ-like基因全长cDNA[J]. 园艺学报， 2007， 34（3）： 649-654.
[17] Emanuelle S， Hossain M I， Moller I E， et al. SnRK1 from Arabidopsis thaliana is an atypical AMPK[J]. Plant Journal， 2015， 82（2）： 183-192.
[18] 张金飞， 李 霞， 谢寅峰. 植物SnRKs家族在胁迫信号通路中的调节作用[J]. 植物学报， 2017， 52（3）： 346-357.
[19] Straus M R， Rietz S， Ver Loren van Themaat E， et al. Salicylic acid antagonism of EDS1-driven cell death is important for immune and oxidative stress responses in Arabidopsis[J]. The Plant Journal， 2010， 62（4）： 628-640.
[20] Xiao X O， Lin W Q， Li K， et al. Early burst of reactive oxygen species positively regulates resistance of eggplant against bacterial wilt[J]. Journal of Phytopathol， 2017， 165： 652-661.
关键词 茄子；EDS1；互作蛋白；青枯病
中图分类号 S436.411 文献标识码 A
Abstract In our previous study， EDS1 of eggplant （SmEDS1） was found positively regulating the bacterial wilt resistance， but the resistance mechanism was not known. To screen the candidate interactors of SmEDS1， the bait protein vector of pGBK7-SmEDS1 was construct to screen the cDNA library by Y2H. The result showed that total nine clones were obtained by two independent experiments. The nine clones encode six proteins including TCP transcriptional factor， DNAJ molecular chaperone， cyanate hydratase， CONSTANS interacting protein 4 and an unknown protein. Based on the known function of the candidate protein， SmEDS1 interacted with the TCP， which regulating the synthesis of salicylic acid and finally regulating the bacterial resistance.
Keywords eggplant； EDS1； interacted protein； bacterial wilt
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.016
EDS1广泛存在于植物中，已从多种植物中如拟南芥、水稻、大豆、葡萄等得到克隆[1]。已有的研究表明，EDS1具有保守的结构域，其蛋白结构可以明显的分为N段的LP结构域和C段的EP结构域，并且LP和EP结构域在EDS1与PAD4、SAG101等互作过程中发挥着重要的作用[1]。
EDS1在植物的抗病过程中发挥着重要的作用，是水杨酸抗病途径中的重要因子，其能调控水杨酸合成基因ICS1和水杨酸下游信号基因的表达[2]。在已有的模型中，EDS1处于水杨酸合成的上游，然而其调控水杨酸合成机理尚不清晰[3]。在EDS1介导的抗病防卫反应中，EDS1主要通过与其他蛋白的互作来调控植物的抗病性。PAD4
是第一个被鉴定出与EDS1存在互作的蛋白[4]。EDS1通过与PAD4的互作激发植物的HR反应进而限制病原菌的繁殖[4-5]，并且越来越多的实验证明，EDS1抗病功能的发挥必须要PAD4的参与[6-7]。同时EDS1还能够与家族内另一成员SAG101产生互作[1]，并且能够形成EDS1-PAD4- SAG101三复合体[5]。PAD4、SAG101与EDS1的互作功能之一是通过调节EDS1在细胞核和细胞质中的分布平衡激活抗病相关基因的表达/生理过程[5]。除了能与PAD4、SAG101互作外，EDS1能够与Avr直接互作，如AvrRps4、HoPA1[8-9]或者直接与RPS4、RPS6、SNC1等R蛋白互作，接受来自R蛋白的信號激活下游的抗病反应[8-9]。
在前期研究中，我们克隆了茄子的SmEDS1，并且通过VIGS技术证明其正调控茄子的青枯病抗性[10]，然而其抗病机理未知。因此，本研究通过构建pGBK7-SmEDS1诱饵载体，筛选我们前期构建的感染青枯病病原菌R. solanacearum的茄子酵母双杂交文库[11]，以期获得与SmEDS1互作的蛋白，为解析SmEDS1抗青枯病机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究使用Clotech公司的酵母双杂交系统。诱饵载体为pGBK7载体。酵母双杂交文库为我们前期构建的感染青枯病病原菌R. solanacearum的茄子酵母双杂交文库[11]。
1.2 方法
1.2.1 pGBK7-SmEDS1诱饵载体的构建 根据SmEDS1的cDNA序列[10]分别在其两端添加Sfi I的酶切位点序列设计引物，用于扩增SmEDS1基因的cDNA片段，引物序列如下：SmEDS1-F：aaGGCC??ATTAC GGCCATGGTGAGAATAGGAG?AGGGTA；SmEDS1-R：ccGGCCGAGGCGGCC-CTAAATATTAATTCGCCCCGA。以cDNA为模板，利用全式金TransStart FastPfu DNA Polymerase克隆目的片段，并将其纯化回收。将目的片段和pGBK7载体利用Sfi I（Fermentas 公司）酶切，然后切胶回收。将回收的目的片段和载体利用DNA Ligation Kit（TOYOBO公司）进行连接，然后用热激法转化大肠杆菌，过夜培养。随机挑取5个大肠杆菌转化子进行PCR检测，并对扩增得到阳性条带的克隆进行质粒抽提和测序。插入片段测序结果经比对确认正确后，进行后续实验。 1.2.2 pGBK7-SmEDS1自激活检测 pGBK7- SmEDS1自激活检测参考Clotech的操作手册。将载体按照表1的组合导入酵母AH109菌株中，进行自激活检测。
1.2.3 文库筛选 文库筛选参考Clotech的操作手册。
1.2.4 互作蛋白生物信息学分析 将得到的克隆提取质粒、测序。并将得到的数据在茄子基因数据库（http：//eggplant. kazusa.or.jp/index.html）和NCBI数据库中进行比对分析。
2 结果与分析
2.1 pGBK7-SmEDS1诱饵载体的构建
PCR产物经过电泳检测得到约2 000 bp大小的片段（图1）。将PCR产物直接进行测序分析，确认该片段为目的片段。将经过过夜培养的菌落，
随机挑选5个进行PCR检测。结果表明，5个菌落均有约2 000 bp大小的片段（图2），为进一步确认载体是否构建成功，挑取1号菌液提取质粒进行测序分析，测序结果表明pGBK7-SmEDS1诱饵载体构建成功。
2.2 pGBK7-SmEDS1无自激活作用
pGBK7-SmEDS1，pGADT7-LargeT/pGBKT7- p53 和pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC在SD-TL缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照（pGA- DT7-largeT+pGBKT7-p53）可在SD-TLHA缺陷平板生长（图3）。pGBKT7-SmEDS1+pGADT7转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生长，生长状态同阴性对照，LacZ检测结果也与阴性对照相同。因此，研究结果表明pGBK7-SmEDS1无自激活作用。
2.3 互作蛋白分析
本研究第一次文库筛选得到的5个初始阳性克隆中1、3和4号菌落能通过ADE2和HIS3报告基因的检测，而2和5号菌落未能通过ADE2和HIS3报告基因检测。而在第二次文库筛选中得到了13个初始阳性克隆，12、13、15、16、17和18共6个菌落通过了ADE2和HIS3报告基因的检测（图4）。因此在本研究中，共得到了与SmEDS1互作的9个克隆。将9个克隆提取质粒，进行测序比对分析，共编码6种蛋白（表2）。4、12和13号克隆分别各编码一种蛋白，而1和3、15和18、16和17分别编码一种蛋白。
3 讨论
SmEDS1在茄子青枯病抗性中发挥着重要的作用。茄子感抗材料接种青枯病病原菌R.solanac-earum后，SmEDS1的表达量均上升，且其在抗病材料的表达量高于感病材料[12]。进一步的研究表明，SmEDS1正调控茄子青枯病抗性，并且能够影响水杨酸途径中的其他信号基因的表达[10]。为进一步研究其抗病机理，本研究利用酵母双杂交手段筛选到6个与其互作的蛋白。
TCP是植物特有的转录因子，其在植物的抗病过程中发挥着重要的作用，其通过调控植物激素的合成来调控植物的抗病反应。Aster Yellows分泌的SAP11能够与AtTCP1和AtTCP2发生互作，并且降低AtTCP2、AtTCP4、AtTCP13、AtTCP3、AtTCP5、AtTCP10、AtTCP17和AtTCP24等8个基因的表达量，从而降低LOX2基因表达，最终抑制内源JA的合成[13]，降低植物的抗病反应。在AtTCP8与SA合成基因ICS1的启动子直接结合，促进内源SA的合成，正调控拟南芥的抗性[14]。进一步的研究表明，AtTCP8能与WRKY，NAC等转录因子互作，形成复合体与ICS1的启动子结合，调控其表达[14]。其中WRKY正调控ICS1的表达，而NAC抑制ICS1的表达[15] 。因此，在不同的条件下，TCPs与不同的转录因子结合，调控ICS1的表达，最终促进或者抑制SA的合成。因此，我们推断SmEDS1可能是通过与SmTCP互作调控水杨酸的合成，进而调控茄子的青枯病抗性。
DNAJ是广泛存在于植物细胞内的一种分子伴侣，胁迫条件下它能够保护细胞内蛋白质等结构的稳定性。李广存等[16]从富集青枯病抗性相關基因的cDNA文库中筛选到了DNAJ同源蛋白，并且证明该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节，可能在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使胁迫损害细胞恢复活性的功能。在茄子受到R.solanacearum胁迫后，SmEDS1可能通过与DNAJ互作来保持蛋白质的活性，进而激发抗病反应。
SnRK1通常是由具催化功能的α亚基、起调节作用的β亚基以及有活化功能的γ亚基组成的多聚体蛋白激酶[17]，在逆境条件下通过调节能量和胁迫信号响应生物与非生物胁迫[18]。SnRKs能通过活性氧以及水杨酸信号途径调控植物对生物胁迫的防卫反应[18]。已有的报道证明EDS1除了参与水杨酸抗病信号途径外，还参与活性氧的抗病途径[19]。本课题组的前期研究也证明了早期活性氧的迸发正调控茄子的青枯病抗性[20]。SmEDS与alpha subunit of SnRK1的互作是否参与了这个过程有待进一步的研究。
基于上述讨论，SmEDS1可能通过与本研究筛选的TCP的互作调控水杨酸的合成，进而调控茄子的青枯病抗性。而SmDNAJ可能有助于保持SmEDS1的活性，SmSnRK1可能调控SmEDS1介导的水杨酸途径和活性氧途径的平衡。
参考文献
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