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【摘要】:目的:探讨一种简单易行、阳性率高的痰涂片结核分枝杆菌检查方法,以达到在非肺科专科医院中对肺结核病患者初筛的更为有效的方法。方法:采用离心沉淀集菌改良法和直接涂片法对100例随机采样痰标本进行抗酸染色镜检,其中直接涂片法采用酒精灯加热,集菌涂片法选用水浴箱恒定加热方式。结果:直接涂片法抗酸染色阳性率为30%,集菌涂片改良法抗酸染色阳性率为64%(P<0.001)。结论:集菌涂片改良法阳性检出率与直接涂片法阳性检出率相比较有显著性差异(P<0.001),且涂片效果清晰,易于辨认,故集菌涂片改良法可作为非肺科医院结核病的初筛试验推广运用。
【关键词】:结核病;集菌涂片;直接涂片;水浴加热
【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517 (2010) 02-041-3
在综合性医院中,结核菌的涂片检查是作为结核病患者的初筛实验,是一种快捷、经济、操作简单的方法,在对结核病患者初筛诊断中起着重要的作用。早发现早治疗,对于患者的康复也是至关重要的,现代结核病控制的基本策略之一就是有效发现和治愈传染源。结核患者的细菌学检查,是发现传染源的最主要途径和手段,是确定结核诊断和治疗方案的重要依据,也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准[1]。涂片染色镜检是目前应用最广泛的细菌学检查方法,如何提高痰涂片结核菌检测阳性率,使检测结果更具说服力,本文研究方案是将集菌涂片法加热方式改为恒温水浴箱加热,而通常实验室采用的直接涂片法加热方式仍为酒精灯加热,用这两种不同的检查方法对所收集的痰标本进行涂片染色镜检,现将检测结果报告如下:
1对象、材料和方法
1.1对象:采集2009年5月份贵阳市肺科医院结核分枝杆菌室合格的门诊、住院病人痰标本100例,标本不区分初诊、复诊、性别、年龄和肺科医院所检测的阴阳性结果,完全随机。
1.2标本采集:采取患者清晨深部痰,洁净水或冷开水漱口后,用力咳嗽以获得的合格痰液盛装于蜡盒内,用密封容器带回待检。
分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。
1.3试剂器材:
抗酸染液:四川省迈克科技有限公司生产的抗酸杆菌染液试剂盒
恒温水浴箱:姜堰市新康医疗器械有限公司,420-A型
离心机:上海安享科学仪器厂,TDL-5-A型
生物安全柜:上海三超净化设备有限公司,SCJ-C-1300II/B
光学显微镜:OLYMPUSCX21FS1
氢氧化钠:重庆北碚化学试剂厂分析纯批号:911114
盐酸:遵义高等师专化学试剂厂分析纯批号:860708
酒精:95%乙醇
立式压力蒸汽灭菌器:江阴滨江医疗设备厂,LS-B75L型
1.4检测方法:(1)新玻片在涂片前在酒精灯火焰上过3次,以达到脱脂目的,待用;(2)将收集来的痰标本先进行直接涂片,涂成2cm×2.5cm椭圆形、圆形、均匀,很少有空白区的厚痰膜三张,待自然干燥;(3)将余下痰液倒入大试管中,加入约2倍体积2%NaOH溶液,加温,37℃消化30min,期间反复摇匀,将上述消化后标本经3000r/min离心30分钟,弃去上清液,取沉淀涂成2cm×2.5cm椭圆形、圆形、均匀,很少有空白区的厚痰膜三张,待自然干燥[2];(4)上述自然干燥后的痰片经酒精灯火焰固定。
1.5染色步骤:参照《全国临床检验操作规程》第三版标准。其中直接涂片加热方式采用酒精灯加热,集菌涂片采用将痰片置于55℃～60℃水浴箱中加热[3],使用四川省迈克科技有限公司生产的抗酸杆菌染液试剂盒,按照说明书进行抗酸染色,干后镜检。
1.6染液质量控制:采用卡介苗做抗酸染液阳性对照;采用大肠埃希菌标准菌株ATCC 25922做抗酸染液阴性对照。
1.7结果判断:参照《全国临床检验操作规程》第三版标准判定。涂片染色后,肉眼观察痰膜呈淡蓝色或蓝色,不得有红色斑块,痰膜脱落部分在10%以下,镜下所见,视野背景清晰,100×油镜的视野内于淡蓝色背景下,抗酸菌呈红色杆菌,其他细菌和细胞呈蓝色。镜下计数100个视野(观察时间不少于4min),未发现抗酸杆菌者继续观察至300个视野,仍未发现抗酸菌者报告抗酸菌阴性(-);镜检按100-300个视野找到抗酸杆菌1～2条者,报告抗酸杆菌可疑(±),或者重新涂片或另留痰标本复查;镜检100个视野内找到抗酸杆菌3～9条者,报告抗酸杆菌阳性(1+);镜检10个视野内找到抗酸杆均1～9条者,报告抗酸杆菌阳性(2+);镜检每个视野内找到抗酸杆菌1～9条者,报告抗酸杆菌阳性(3+);镜检每个视野内找到抗酸杆菌多于9条以上者,报告抗酸杆菌阳性(4+)为标准,镜检各方法染色涂片三张后综合结果进行记录、统计。
2结果
2.1数据统计:
由上表可知,集菌涂片改良法阳性检出率显著高于直接涂片法阳性检出率(P<0.001),两者有显著性差异。
上表结果中,集菌涂片法的2+的结果中,>1+的结果有6例,4+的结果中,>4+的结果有5例
2.2显微镜摄影结果对比:
3讨论
3.1从结果中可以看出,两种方法相比较有显著性差异(P<0.001),集菌涂片改良法阳性检出率远远高于直接涂片法,且从数据统计及图片中可看出,在同一份标本中,集菌改良法的阳性程度高于直接涂片法,集菌改良法镜检结果大于直接法镜检结果的共有11例,涂片所示,集菌改良法镜检显示抗酸杆菌数量上有明显提高。由于NaOH的消化作用,使得集菌法的镜下显示背景清晰,与抗酸杆菌的着色有较大反差,更易于辨认(如图示),减少了漏检的机率,增加其阳性检出率。
本文采用两种方法检验的100例痰液标本中,集菌改良法64例阳性中,直接涂片法只有30例阳性,其余均为阴性。两种方法对100例痰检阳性结果相比较,在相同判断标准下,两种方法检出阳性结果只有30例完全相符合,集菌改良法检出的64例阳性结果在直接法中的阳性程度均减少甚至为阴性。
3.2直接涂片法在实验过程中存在以下几点问题:①涂片时厚片与薄片在镜检时,结果有很大差别;②由于直接法只是挑取痰液进行涂片,是否挑至有效部位(菌量较多处、血性、脓性部分),将对结果有很大影响;③由于痰液直接被涂片,致使染色后,镜下其他细胞较多,在患者带菌量较少时,呈红色的抗酸杆菌可能会与蓝色的其他细胞作为的背景融合,不利于检验人员对抗酸杆菌的识别;④加热不易控制。以上几点均会出现假阴性结果,但其操作简单,耗时较短为其优点。而本文所采用的集菌涂片改良法方式有以下几点优势:①本研究采用的消化液为2%NaOH溶液,该试剂价格便宜,且消化时不需进行高压灭菌处理[4],大幅缩短了该法的实验耗时;②本研究的方法是针对所采集患者的全部痰液,即采集到的患者痰液全部进行消化处理,消化结束后经3000r/min离心30min处理,使痰液中未被消化的抗酸杆菌充分沉淀;③经此处理后的痰液,沉淀下来的菌量较大,因此该法在涂片时无需区分厚片与薄片;④经消化处理后的痰液液化较充分,除抗酸杆菌外的其他细菌被消化,使染色后,镜下所见背景较清晰,易于检验人员对抗酸杆菌的识别(如图示),提高了阳性检出率,有效避免假阴性结果的出现。但此法相对于直接涂片法操作时间较长、步骤较多。
3.3抗酸染色法作为结核病细菌诊断的经典方法之一沿用至今,但成功染成一张质量较好的涂片尚有一定难度,制片影响因素较多。
本研究采用两种涂片染色法同时,直接涂片法仍采用酒精灯对痰片进行加热,而集菌改良法加热方式选择为55℃～60℃恒温水浴箱对痰片进行加热,该法在使用时温度恒定,有助于染液与抗酸杆菌的充分结合,使菌体着色较为充分,染色效果较好,配以集菌法的天然优势,使镜下所示,抗酸杆菌的着色与背景颜色有较大的反差,有利于检验人员的识别(如图示),而传统的酒精灯加热,加热时间与温度很难把握,极易造成加热时间过长、温度过高、染液干涸等,这些都将导致菌体变性,直接影响在镜检时的效果。
综上所述,痰液集菌涂片改良法抗酸染色可大幅提高其阳性检出率,配合水浴箱加热法,是一种简单易行、阳性率高的方法,适合在广大综合性医院中作为肺结核患者的初筛试验,对肺结核病患者的早日康复有着重要意义。此外,标本质量也至关重要,一份合格的痰标本,加之阳性率高的检查方法,可更进一步提高痰液中抗酸杆菌的检出,因此,在临床采集标本时应特别注意,这样才可真正达到肺结核患者在非肺科专科医院中的初筛目的。
4结论
集菌涂片法阳性检出率与直接涂片法阳性检出率有显著性差异(P<0.001),故集菌涂片改良法可作为非肺科医院结核病的初筛试验。
参考文献
[1] 王钊,吴明江.全国结核病防治手册,1997:27.
[2] 汪胖,邵春阳.结核杆菌离心浓集法的改进及临床应用,工企医刊,2001年(第14卷)第4期:5.
[3] 胡永林.用水浴蒸汽加热替代火焰加热进行抗酸染色[J].临床检验杂志,2008年(第26卷)第1期:19.
[4] 李阳辰,王水亮,许小广.快速集留法查抗酸杆菌的评价[J].中国防疥杂志,1999,(21):7.
[5] Fodor T Tuberde 1984,65:12.
[6] 汪胖,邵春阳.结核杆菌离心浓集法的改进及临床应用[J].工企医刊,2001年(第14卷)第4期:5.
【关键词】:结核病;集菌涂片;直接涂片;水浴加热
【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517 (2010) 02-041-3
在综合性医院中,结核菌的涂片检查是作为结核病患者的初筛实验,是一种快捷、经济、操作简单的方法,在对结核病患者初筛诊断中起着重要的作用。早发现早治疗,对于患者的康复也是至关重要的,现代结核病控制的基本策略之一就是有效发现和治愈传染源。结核患者的细菌学检查,是发现传染源的最主要途径和手段,是确定结核诊断和治疗方案的重要依据,也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准[1]。涂片染色镜检是目前应用最广泛的细菌学检查方法,如何提高痰涂片结核菌检测阳性率,使检测结果更具说服力,本文研究方案是将集菌涂片法加热方式改为恒温水浴箱加热,而通常实验室采用的直接涂片法加热方式仍为酒精灯加热,用这两种不同的检查方法对所收集的痰标本进行涂片染色镜检,现将检测结果报告如下:
1对象、材料和方法
1.1对象:采集2009年5月份贵阳市肺科医院结核分枝杆菌室合格的门诊、住院病人痰标本100例,标本不区分初诊、复诊、性别、年龄和肺科医院所检测的阴阳性结果,完全随机。
1.2标本采集:采取患者清晨深部痰,洁净水或冷开水漱口后,用力咳嗽以获得的合格痰液盛装于蜡盒内,用密封容器带回待检。
分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。
1.3试剂器材:
抗酸染液:四川省迈克科技有限公司生产的抗酸杆菌染液试剂盒
恒温水浴箱:姜堰市新康医疗器械有限公司,420-A型
离心机:上海安享科学仪器厂,TDL-5-A型
生物安全柜:上海三超净化设备有限公司,SCJ-C-1300II/B
光学显微镜:OLYMPUSCX21FS1
氢氧化钠:重庆北碚化学试剂厂分析纯批号:911114
盐酸:遵义高等师专化学试剂厂分析纯批号:860708
酒精:95%乙醇
立式压力蒸汽灭菌器:江阴滨江医疗设备厂,LS-B75L型
1.4检测方法:(1)新玻片在涂片前在酒精灯火焰上过3次,以达到脱脂目的,待用;(2)将收集来的痰标本先进行直接涂片,涂成2cm×2.5cm椭圆形、圆形、均匀,很少有空白区的厚痰膜三张,待自然干燥;(3)将余下痰液倒入大试管中,加入约2倍体积2%NaOH溶液,加温,37℃消化30min,期间反复摇匀,将上述消化后标本经3000r/min离心30分钟,弃去上清液,取沉淀涂成2cm×2.5cm椭圆形、圆形、均匀,很少有空白区的厚痰膜三张,待自然干燥[2];(4)上述自然干燥后的痰片经酒精灯火焰固定。
1.5染色步骤:参照《全国临床检验操作规程》第三版标准。其中直接涂片加热方式采用酒精灯加热,集菌涂片采用将痰片置于55℃～60℃水浴箱中加热[3],使用四川省迈克科技有限公司生产的抗酸杆菌染液试剂盒,按照说明书进行抗酸染色,干后镜检。
1.6染液质量控制:采用卡介苗做抗酸染液阳性对照;采用大肠埃希菌标准菌株ATCC 25922做抗酸染液阴性对照。
1.7结果判断:参照《全国临床检验操作规程》第三版标准判定。涂片染色后,肉眼观察痰膜呈淡蓝色或蓝色,不得有红色斑块,痰膜脱落部分在10%以下,镜下所见,视野背景清晰,100×油镜的视野内于淡蓝色背景下,抗酸菌呈红色杆菌,其他细菌和细胞呈蓝色。镜下计数100个视野(观察时间不少于4min),未发现抗酸杆菌者继续观察至300个视野,仍未发现抗酸菌者报告抗酸菌阴性(-);镜检按100-300个视野找到抗酸杆菌1～2条者,报告抗酸杆菌可疑(±),或者重新涂片或另留痰标本复查;镜检100个视野内找到抗酸杆菌3～9条者,报告抗酸杆菌阳性(1+);镜检10个视野内找到抗酸杆均1～9条者,报告抗酸杆菌阳性(2+);镜检每个视野内找到抗酸杆菌1～9条者,报告抗酸杆菌阳性(3+);镜检每个视野内找到抗酸杆菌多于9条以上者,报告抗酸杆菌阳性(4+)为标准,镜检各方法染色涂片三张后综合结果进行记录、统计。
2结果
2.1数据统计:
由上表可知,集菌涂片改良法阳性检出率显著高于直接涂片法阳性检出率(P<0.001),两者有显著性差异。
上表结果中,集菌涂片法的2+的结果中,>1+的结果有6例,4+的结果中,>4+的结果有5例
2.2显微镜摄影结果对比:
3讨论
3.1从结果中可以看出,两种方法相比较有显著性差异(P<0.001),集菌涂片改良法阳性检出率远远高于直接涂片法,且从数据统计及图片中可看出,在同一份标本中,集菌改良法的阳性程度高于直接涂片法,集菌改良法镜检结果大于直接法镜检结果的共有11例,涂片所示,集菌改良法镜检显示抗酸杆菌数量上有明显提高。由于NaOH的消化作用,使得集菌法的镜下显示背景清晰,与抗酸杆菌的着色有较大反差,更易于辨认(如图示),减少了漏检的机率,增加其阳性检出率。
本文采用两种方法检验的100例痰液标本中,集菌改良法64例阳性中,直接涂片法只有30例阳性,其余均为阴性。两种方法对100例痰检阳性结果相比较,在相同判断标准下,两种方法检出阳性结果只有30例完全相符合,集菌改良法检出的64例阳性结果在直接法中的阳性程度均减少甚至为阴性。
3.2直接涂片法在实验过程中存在以下几点问题:①涂片时厚片与薄片在镜检时,结果有很大差别;②由于直接法只是挑取痰液进行涂片,是否挑至有效部位(菌量较多处、血性、脓性部分),将对结果有很大影响;③由于痰液直接被涂片,致使染色后,镜下其他细胞较多,在患者带菌量较少时,呈红色的抗酸杆菌可能会与蓝色的其他细胞作为的背景融合,不利于检验人员对抗酸杆菌的识别;④加热不易控制。以上几点均会出现假阴性结果,但其操作简单,耗时较短为其优点。而本文所采用的集菌涂片改良法方式有以下几点优势:①本研究采用的消化液为2%NaOH溶液,该试剂价格便宜,且消化时不需进行高压灭菌处理[4],大幅缩短了该法的实验耗时;②本研究的方法是针对所采集患者的全部痰液,即采集到的患者痰液全部进行消化处理,消化结束后经3000r/min离心30min处理,使痰液中未被消化的抗酸杆菌充分沉淀;③经此处理后的痰液,沉淀下来的菌量较大,因此该法在涂片时无需区分厚片与薄片;④经消化处理后的痰液液化较充分,除抗酸杆菌外的其他细菌被消化,使染色后,镜下所见背景较清晰,易于检验人员对抗酸杆菌的识别(如图示),提高了阳性检出率,有效避免假阴性结果的出现。但此法相对于直接涂片法操作时间较长、步骤较多。
3.3抗酸染色法作为结核病细菌诊断的经典方法之一沿用至今,但成功染成一张质量较好的涂片尚有一定难度,制片影响因素较多。
本研究采用两种涂片染色法同时,直接涂片法仍采用酒精灯对痰片进行加热,而集菌改良法加热方式选择为55℃～60℃恒温水浴箱对痰片进行加热,该法在使用时温度恒定,有助于染液与抗酸杆菌的充分结合,使菌体着色较为充分,染色效果较好,配以集菌法的天然优势,使镜下所示,抗酸杆菌的着色与背景颜色有较大的反差,有利于检验人员的识别(如图示),而传统的酒精灯加热,加热时间与温度很难把握,极易造成加热时间过长、温度过高、染液干涸等,这些都将导致菌体变性,直接影响在镜检时的效果。
综上所述,痰液集菌涂片改良法抗酸染色可大幅提高其阳性检出率,配合水浴箱加热法,是一种简单易行、阳性率高的方法,适合在广大综合性医院中作为肺结核患者的初筛试验,对肺结核病患者的早日康复有着重要意义。此外,标本质量也至关重要,一份合格的痰标本,加之阳性率高的检查方法,可更进一步提高痰液中抗酸杆菌的检出,因此,在临床采集标本时应特别注意,这样才可真正达到肺结核患者在非肺科专科医院中的初筛目的。
4结论
集菌涂片法阳性检出率与直接涂片法阳性检出率有显著性差异(P<0.001),故集菌涂片改良法可作为非肺科医院结核病的初筛试验。
参考文献
[1] 王钊,吴明江.全国结核病防治手册,1997:27.
[2] 汪胖,邵春阳.结核杆菌离心浓集法的改进及临床应用,工企医刊,2001年(第14卷)第4期:5.
[3] 胡永林.用水浴蒸汽加热替代火焰加热进行抗酸染色[J].临床检验杂志,2008年(第26卷)第1期:19.
[4] 李阳辰,王水亮,许小广.快速集留法查抗酸杆菌的评价[J].中国防疥杂志,1999,(21):7.
[5] Fodor T Tuberde 1984,65:12.
[6] 汪胖,邵春阳.结核杆菌离心浓集法的改进及临床应用[J].工企医刊,2001年(第14卷)第4期:5.