论文部分内容阅读
【摘 要】 目的：测定山萸肉加工过程的下脚料-果核的果壳果仁中白桦脂酸和熊果酸的含量。方法：采用WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：甲醇-水-磷酸 （80∶20∶0.08）;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：210 nm;进样量：10.0 μL。结果：山茱萸果壳中白桦脂酸的含量范围为3.65～5.34 mg·g-1，熊果酸的含量范围为0.87～1.72mg·g-1。山茱萸果仁中白桦脂酸的含量范围为3.61～4.97 mg·g-1，熊果酸的含量范围为4.88～7.46 mg·g-1。结论：实验建立的山茱萸果核中果壳和果仁的白桦脂酸和熊果酸的含量测定方法稳定、可靠，可以用来科学评价山茱萸果核中白桦脂酸和熊果酸的含量，为山茱萸果核的开发利用奠定基础。
【关键词】 山茱萸;白桦脂酸;熊果酸;含量测定
【中图分类号】R917 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）16-0045-04
Determination of Betulinic Acid and Ursolic Acid in the Nutlet of Cornus officinalis
LI Jun JIANG Hua* ZHANG Ning WANG Qi CHEN Wenwen SONG Wenbo
Chemical Engineering and Pharmaceutics College， Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003， China
Abstract：Objective To determine the content of betulinic acid and ursolic acid inthe shell and kernel of the nutlet of Cornus officinals Sieb.et Zucc..Methods A HPLC method was employed to determine the betulinic acid and ureolic acid contents， which was carried out on a WondaSil C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with the mobile phase of methanol-water-H3PO4（80∶20∶0.08） and the flow rate at 1.0 mL·min-1and the wavelengths of 210 nm.Results The content of betulinic acid in the shell and kernel ranged from 3.65～5.34 mg·g-1and 3.61～4.97 mg·g-1.And the content of ursolic acid in the shell and kernel ranged from 0.87～1.72 mg·g-1and 4.88～7.46 mg·g-1.In general， the content of betulinic acid is higher than that of ursolic acid because the weight of the shell in the nutlet is heavier than that of the kernel.Conclusion This method is simple and reliable， which can be used for the determination of betulinic acid and ureolic acid in the nutlet of Cornus officinals Sieb.et Zucc.
Keywords：Cornus officinals Sieb.et Zucc.; Betulinic Acid; Ursolic Acid; Content Determination
山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）為山茱萸科山茱萸属植物，为落叶乔木或灌木，集中分布于我国豫、陕、鄂、浙等省。生于海拔400～1500 m，的林缘或森林中。
山茱萸果实的果肉是一味常用中药材，称之为山萸肉、枣皮等，中医临床用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱等症[1]。现代药理学[2-5]证实山茱萸中的成分具有神经保护、心肌保护、抗肿瘤、抗氧化等作用。山萸肉临床用量较大，然而在加工过程中，剩余的果核基本是遗弃处理。这种做法不仅不利于环保，同时也造成很大的浪费。因此，对山茱萸果核的再利用，就显得尤为重要。文献检索显示，山茱萸果核已经被用来制备活性炭[6]、提取栲胶[7]等，然而这些方法对山茱萸果核的利用程度较低。
为了进一步挖掘山茱萸果核的利用价值，前期对山茱萸果核中化学成分进行了研究，发现其中含有较多的白桦脂酸和熊果酸。白桦脂酸具有镇咳祛痰、清热利湿、消肿解毒、提高机体免疫力、调血脂、抗肿瘤等作用[8]，熊果酸则具有杀虫、消炎、防流感、抗糖尿病等功能[9]。然而，目前未见有对于山茱萸果核中果壳和果仁的白桦脂酸和熊果酸含量测定的报道，这极大限制了山茱萸果核中该类成分的利用。基于此，本实验建立同时测定山茱萸果核中果壳和果仁的白桦脂酸和熊果酸的方法，并采用该方法测定多个产地山茱萸果核的果壳果仁中白桦脂酸和熊果酸的含量。
1 材料 1.1 材料与试剂 白桦脂酸和熊果酸（购自上海源叶生物科技公司）;山茱萸果核（南阳西峡，洛阳嵩县的车村、旧县、纸坊，洛阳栾川的三川、冷水、叫河），经河南科技大学医学院路西明教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）成熟果实的果核;甲醇（DIKMA公司，色谱纯），重蒸水自制，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备 Shimazu LC-15C高效液相色谱仪;旋转蒸发仪（RE-52AA，郑州长城科工贸有限公司）;数控超声波清洗器（KQ500DE型，昆山市超声仪器有限公司）;电子分析天平（FA2004B型，上海佑科仪器仪表有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（DHG101-3A型，巩义予华仪器有限公司）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：甲醇-水-磷酸 （80∶20∶0.08）;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：210 nm;进样量：10.0 μL。在此色谱条件下，白桦脂酸和熊果酸分离度良好。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的白桦脂酸和熊果酸对照品适量，置于同一10 mL 容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制得白桦脂酸浓度为 0.21 g·L-1和熊果酸浓度为0.20 g·L-1的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取大小均匀的山茱萸果核适量，分离出果壳和果仁，粉碎，分别精密称取0.5 g，置于不同的容量瓶中，加甲醇10 mL，精密称重，然后超声提取0.5 h，用甲醇补足至原重，混合均匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取取滤液，即得。
2.4 线性关系考察 精密吸取白桦脂酸和熊果酸的对照品溶液2.0、5.0、10.0、 15.0、20.0 μL注入液相色谱仪，依“2.1”项下色谱条件记录峰面积。以峰面积（Y×10-5）為纵坐标，进样量（X）为横坐标进行线性回归，得白桦脂酸和熊果酸的回归方程分别为：Y=3.6246X-0.009（r=0.999 8）;Y=6.0447X-0.0723（r=0.999 8）。白桦脂酸和熊果酸的线性范围分别为：0.42～4.2 μg，0.4～4.0 μg。
2.5 精密度考察 取南阳西峡产山茱萸果核的果壳和果核粉末0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样5 次，每次10.0 μL，测定峰面积。结果果壳和果核中白桦脂酸和熊果酸峰面积的RSD 值分别为1.1%、0.7%和1.8%、2.1%，表明精密度良好。
2.6 稳定性考察 取南阳西峡产山茱萸果核的果壳和果核粉末0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、10、12 h 进样，每次10.0 μL，测定峰面积。结果果壳和果核中白桦脂酸和熊果酸峰面积的RSD 值分别为1.5%、1.0%和0.8%、1.3%，表明供试品溶液在12 h 内基本稳定。
2.7 重现性考察 取南阳西峡产山茱萸果核的果壳和果核粉末5 份，每份0.5 g，精密称定，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液10.0 μL 进样，测定峰面积并计算含量。结果果壳中白桦脂酸和熊果酸含量的含量分别为4.29 mg·g-1、1.14 mg·g-1，RSD 值分别为0.7%、2.2%;果仁中白桦脂酸和熊果酸含量分别为3.80 mg·g-1、5.61 mg·g-1，RSD 值分别为2.0%，1.4%。表明该方法重复性良好。
2.8 回收率考察 精密称取已知含量的南阳西峡产山茱萸果核的果壳和果核粉末各9 份，每份0.25 g，各分成3 组，每组3 份，以白桦脂酸和熊果酸含量的80%、100%、120%为梯度，分别精密加入各对照品溶液适量，按供试品溶液制备方法操作，并进样。计算平均加样回收率，结果见表1。
2.9 样品测定 取不同产地的山茱萸果核，按照2.2.3项下的方法制备供试品溶液，并依法测定，计算样品中白桦酯酸和熊果酸的含量，结果见表2。可见，山茱萸果壳中白桦脂酸的含量范围为3.65～5.34 mg·g-1，熊果酸的含量范围为0.87～1.72 mg·g-1。山茱萸果仁中白桦脂酸的含量范围为3.61～4.97 mg·g-1，熊果酸的含量范围为4.88～7.46 mg·g-1。
3 讨论
白桦脂酸和熊果酸的结构中均含有一个羧基，呈弱酸性，在中性的流动相中可发生电离，在色谱柱分离过程中形成拖尾峰，影响分离效果，而在流动相中加酸是抑制酸性成分电离的有效方法[10]。本实验中分别尝试了磷酸和冰醋酸来调整流动相的酸性，结果表明磷酸的效果较好，而冰醋酸的效果较差。至于磷酸的加入量，从0.01%开始逐渐增加，发现随着流动相中磷酸含量的逐渐增加，白桦脂酸和熊果酸的峰形逐渐改善，其中白桦脂酸的效果尤为明显。当磷酸的含量增加到0.08%的比例时，白桦脂酸和熊果酸基本呈正态峰，且分离度良好，因此确定流动相中磷酸的加入量为0.08%。
将白桦脂酸和熊果酸在200～400 nm范围内进行波长扫描，结果显示，该二成分均没有最大吸收峰，在200～220 nm之间存在末端吸收。因此，将检测波长确定在210 nm。
表2中测定的结果显示，山茱萸果壳中白桦脂酸的含量偏高，而在果仁中熊果酸的含量偏高。果壳样品中白桦脂酸含量最高的是栾川叫河样品，最低的为栾川三川的样品。在山茱萸的果仁中，熊果酸的含量最高的是栾川三川和嵩县车村样品，最低的是嵩县旧县的样品。
本实验建立的山茱萸果核中果壳和果仁的白桦脂酸和熊果酸含量测定方法稳定、可靠，为山茱萸果核中白桦脂酸和熊果酸的利用奠定基础。
参考文献 [1]國家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：27.
[2]丁月霞，张丽，叶翠飞，等.山茱萸环烯醚萜苷对穹隆海马伞切断大鼠海马区神经元存活和细胞凋亡调控因子的影响[J].首都医科大学学报，2011，32（1）：73-78.
[3]陈克芳，李建军，潘爱珍，等.山茱萸总苷干预急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2012，10（12）：1488-1489.
[4]邹品文，赵春景，李攀，等.山茱萸多糖的抗肿瘤作用及其免疫机制[J].中国医院药学杂志，2012，32（1）：20-22.
[5]陈玉霞，刘建华，林峰，等.DPPH和FRAP法测定41种中草药抗氧化活性[J].实验室研究与探索，2011，30（6）：11-14.
[6]张强，朱铭强，蒋花，等.山茱萸果核制备活性炭的工艺研究[J].中南林业科技大学学报， 2011，31（11）：146-152.
[7]周力，马齐兵，陈哲，等. 山茱萸籽栲胶制备工艺的研究[J]. 食品工业，2016，37（8）：35-40.
[8] 周映霞，王振国，马莉， 等.白桦酯酸及其衍生物的研究概况[J].中国药学杂志，2005，39（6）：405-407.
[9]赵雅楠，张小莉，江华.熊果酸的抗糖尿病作用现状研究进展[J].中医临床研究，2016，8（29）：142-145.
[10]胡芳，赵智慧，刘孟军.HPLC法测定不同枣品种果实中白桦酯酸、齐墩果酸和熊果酸含量[J].中国农学通报， 2010，27（5）：434-438.
（收稿日期：2021-01-15 编辑：刘 斌）
基金项目：河南省科技攻关项目（No.182102311125）;河南科技大学博士科研启动基金项目（13480058）河南科技大学大学生训练计划（2020139，2020143）。
作者简介：李军（1978-），男，汉族，博士，副教授、硕士生导师，研究方向为中药活性成分（组）研究。E-mail：huomanlee@126.com
通信作者：姜华（1981-）， 女，汉族，博士，副教授，研究方向为中药活性成分（组）研究。E-mail： hltl2003@126.com
【关键词】 山茱萸;白桦脂酸;熊果酸;含量测定
【中图分类号】R917 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）16-0045-04
Determination of Betulinic Acid and Ursolic Acid in the Nutlet of Cornus officinalis
LI Jun JIANG Hua* ZHANG Ning WANG Qi CHEN Wenwen SONG Wenbo
Chemical Engineering and Pharmaceutics College， Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003， China
Abstract：Objective To determine the content of betulinic acid and ursolic acid inthe shell and kernel of the nutlet of Cornus officinals Sieb.et Zucc..Methods A HPLC method was employed to determine the betulinic acid and ureolic acid contents， which was carried out on a WondaSil C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with the mobile phase of methanol-water-H3PO4（80∶20∶0.08） and the flow rate at 1.0 mL·min-1and the wavelengths of 210 nm.Results The content of betulinic acid in the shell and kernel ranged from 3.65～5.34 mg·g-1and 3.61～4.97 mg·g-1.And the content of ursolic acid in the shell and kernel ranged from 0.87～1.72 mg·g-1and 4.88～7.46 mg·g-1.In general， the content of betulinic acid is higher than that of ursolic acid because the weight of the shell in the nutlet is heavier than that of the kernel.Conclusion This method is simple and reliable， which can be used for the determination of betulinic acid and ureolic acid in the nutlet of Cornus officinals Sieb.et Zucc.
Keywords：Cornus officinals Sieb.et Zucc.; Betulinic Acid; Ursolic Acid; Content Determination
山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）為山茱萸科山茱萸属植物，为落叶乔木或灌木，集中分布于我国豫、陕、鄂、浙等省。生于海拔400～1500 m，的林缘或森林中。
山茱萸果实的果肉是一味常用中药材，称之为山萸肉、枣皮等，中医临床用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱等症[1]。现代药理学[2-5]证实山茱萸中的成分具有神经保护、心肌保护、抗肿瘤、抗氧化等作用。山萸肉临床用量较大，然而在加工过程中，剩余的果核基本是遗弃处理。这种做法不仅不利于环保，同时也造成很大的浪费。因此，对山茱萸果核的再利用，就显得尤为重要。文献检索显示，山茱萸果核已经被用来制备活性炭[6]、提取栲胶[7]等，然而这些方法对山茱萸果核的利用程度较低。
为了进一步挖掘山茱萸果核的利用价值，前期对山茱萸果核中化学成分进行了研究，发现其中含有较多的白桦脂酸和熊果酸。白桦脂酸具有镇咳祛痰、清热利湿、消肿解毒、提高机体免疫力、调血脂、抗肿瘤等作用[8]，熊果酸则具有杀虫、消炎、防流感、抗糖尿病等功能[9]。然而，目前未见有对于山茱萸果核中果壳和果仁的白桦脂酸和熊果酸含量测定的报道，这极大限制了山茱萸果核中该类成分的利用。基于此，本实验建立同时测定山茱萸果核中果壳和果仁的白桦脂酸和熊果酸的方法，并采用该方法测定多个产地山茱萸果核的果壳果仁中白桦脂酸和熊果酸的含量。
1 材料 1.1 材料与试剂 白桦脂酸和熊果酸（购自上海源叶生物科技公司）;山茱萸果核（南阳西峡，洛阳嵩县的车村、旧县、纸坊，洛阳栾川的三川、冷水、叫河），经河南科技大学医学院路西明教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）成熟果实的果核;甲醇（DIKMA公司，色谱纯），重蒸水自制，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备 Shimazu LC-15C高效液相色谱仪;旋转蒸发仪（RE-52AA，郑州长城科工贸有限公司）;数控超声波清洗器（KQ500DE型，昆山市超声仪器有限公司）;电子分析天平（FA2004B型，上海佑科仪器仪表有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（DHG101-3A型，巩义予华仪器有限公司）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：甲醇-水-磷酸 （80∶20∶0.08）;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：210 nm;进样量：10.0 μL。在此色谱条件下，白桦脂酸和熊果酸分离度良好。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的白桦脂酸和熊果酸对照品适量，置于同一10 mL 容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制得白桦脂酸浓度为 0.21 g·L-1和熊果酸浓度为0.20 g·L-1的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取大小均匀的山茱萸果核适量，分离出果壳和果仁，粉碎，分别精密称取0.5 g，置于不同的容量瓶中，加甲醇10 mL，精密称重，然后超声提取0.5 h，用甲醇补足至原重，混合均匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取取滤液，即得。
2.4 线性关系考察 精密吸取白桦脂酸和熊果酸的对照品溶液2.0、5.0、10.0、 15.0、20.0 μL注入液相色谱仪，依“2.1”项下色谱条件记录峰面积。以峰面积（Y×10-5）為纵坐标，进样量（X）为横坐标进行线性回归，得白桦脂酸和熊果酸的回归方程分别为：Y=3.6246X-0.009（r=0.999 8）;Y=6.0447X-0.0723（r=0.999 8）。白桦脂酸和熊果酸的线性范围分别为：0.42～4.2 μg，0.4～4.0 μg。
2.5 精密度考察 取南阳西峡产山茱萸果核的果壳和果核粉末0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样5 次，每次10.0 μL，测定峰面积。结果果壳和果核中白桦脂酸和熊果酸峰面积的RSD 值分别为1.1%、0.7%和1.8%、2.1%，表明精密度良好。
2.6 稳定性考察 取南阳西峡产山茱萸果核的果壳和果核粉末0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、10、12 h 进样，每次10.0 μL，测定峰面积。结果果壳和果核中白桦脂酸和熊果酸峰面积的RSD 值分别为1.5%、1.0%和0.8%、1.3%，表明供试品溶液在12 h 内基本稳定。
2.7 重现性考察 取南阳西峡产山茱萸果核的果壳和果核粉末5 份，每份0.5 g，精密称定，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液10.0 μL 进样，测定峰面积并计算含量。结果果壳中白桦脂酸和熊果酸含量的含量分别为4.29 mg·g-1、1.14 mg·g-1，RSD 值分别为0.7%、2.2%;果仁中白桦脂酸和熊果酸含量分别为3.80 mg·g-1、5.61 mg·g-1，RSD 值分别为2.0%，1.4%。表明该方法重复性良好。
2.8 回收率考察 精密称取已知含量的南阳西峡产山茱萸果核的果壳和果核粉末各9 份，每份0.25 g，各分成3 组，每组3 份，以白桦脂酸和熊果酸含量的80%、100%、120%为梯度，分别精密加入各对照品溶液适量，按供试品溶液制备方法操作，并进样。计算平均加样回收率，结果见表1。
2.9 样品测定 取不同产地的山茱萸果核，按照2.2.3项下的方法制备供试品溶液，并依法测定，计算样品中白桦酯酸和熊果酸的含量，结果见表2。可见，山茱萸果壳中白桦脂酸的含量范围为3.65～5.34 mg·g-1，熊果酸的含量范围为0.87～1.72 mg·g-1。山茱萸果仁中白桦脂酸的含量范围为3.61～4.97 mg·g-1，熊果酸的含量范围为4.88～7.46 mg·g-1。
3 讨论
白桦脂酸和熊果酸的结构中均含有一个羧基，呈弱酸性，在中性的流动相中可发生电离，在色谱柱分离过程中形成拖尾峰，影响分离效果，而在流动相中加酸是抑制酸性成分电离的有效方法[10]。本实验中分别尝试了磷酸和冰醋酸来调整流动相的酸性，结果表明磷酸的效果较好，而冰醋酸的效果较差。至于磷酸的加入量，从0.01%开始逐渐增加，发现随着流动相中磷酸含量的逐渐增加，白桦脂酸和熊果酸的峰形逐渐改善，其中白桦脂酸的效果尤为明显。当磷酸的含量增加到0.08%的比例时，白桦脂酸和熊果酸基本呈正态峰，且分离度良好，因此确定流动相中磷酸的加入量为0.08%。
将白桦脂酸和熊果酸在200～400 nm范围内进行波长扫描，结果显示，该二成分均没有最大吸收峰，在200～220 nm之间存在末端吸收。因此，将检测波长确定在210 nm。
表2中测定的结果显示，山茱萸果壳中白桦脂酸的含量偏高，而在果仁中熊果酸的含量偏高。果壳样品中白桦脂酸含量最高的是栾川叫河样品，最低的为栾川三川的样品。在山茱萸的果仁中，熊果酸的含量最高的是栾川三川和嵩县车村样品，最低的是嵩县旧县的样品。
本实验建立的山茱萸果核中果壳和果仁的白桦脂酸和熊果酸含量测定方法稳定、可靠，为山茱萸果核中白桦脂酸和熊果酸的利用奠定基础。
参考文献 [1]國家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：27.
[2]丁月霞，张丽，叶翠飞，等.山茱萸环烯醚萜苷对穹隆海马伞切断大鼠海马区神经元存活和细胞凋亡调控因子的影响[J].首都医科大学学报，2011，32（1）：73-78.
[3]陈克芳，李建军，潘爱珍，等.山茱萸总苷干预急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2012，10（12）：1488-1489.
[4]邹品文，赵春景，李攀，等.山茱萸多糖的抗肿瘤作用及其免疫机制[J].中国医院药学杂志，2012，32（1）：20-22.
[5]陈玉霞，刘建华，林峰，等.DPPH和FRAP法测定41种中草药抗氧化活性[J].实验室研究与探索，2011，30（6）：11-14.
[6]张强，朱铭强，蒋花，等.山茱萸果核制备活性炭的工艺研究[J].中南林业科技大学学报， 2011，31（11）：146-152.
[7]周力，马齐兵，陈哲，等. 山茱萸籽栲胶制备工艺的研究[J]. 食品工业，2016，37（8）：35-40.
[8] 周映霞，王振国，马莉， 等.白桦酯酸及其衍生物的研究概况[J].中国药学杂志，2005，39（6）：405-407.
[9]赵雅楠，张小莉，江华.熊果酸的抗糖尿病作用现状研究进展[J].中医临床研究，2016，8（29）：142-145.
[10]胡芳，赵智慧，刘孟军.HPLC法测定不同枣品种果实中白桦酯酸、齐墩果酸和熊果酸含量[J].中国农学通报， 2010，27（5）：434-438.
（收稿日期：2021-01-15 编辑：刘 斌）
基金项目：河南省科技攻关项目（No.182102311125）;河南科技大学博士科研启动基金项目（13480058）河南科技大学大学生训练计划（2020139，2020143）。
作者简介：李军（1978-），男，汉族，博士，副教授、硕士生导师，研究方向为中药活性成分（组）研究。E-mail：huomanlee@126.com
通信作者：姜华（1981-）， 女，汉族，博士，副教授，研究方向为中药活性成分（组）研究。E-mail： hltl2003@126.com