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摘要[目的]建立延龄草愈伤组织诱导、增殖和分化再生体系。[方法]以延龄草块根、根尖为外植体，应用正交试验方法设计植物生长调节剂组合和质量浓度配比，研究植物生长调节剂对延龄草愈伤组织形成、增殖和分化的影响。[结果]1/2MS是最适合延龄草块根、根尖诱导愈伤的培养基，添加6BA 1.2 mg/L和IAA 0.6 mg/L的1/2MS培养基最适合于愈伤组织的诱导，其中以根尖愈伤组织的诱导效果最好，在添加6BA 0.5 mg/L、IAA 0.6 mg/L的培养基中，愈伤组织的分化率最高，附加6BA 1.2 mg/L、IAA 1.0 mg/L的1/2MS培养基为生根适宜培养基。[结论]延龄草的块茎和根尖外植体在适宜的激素组合中均可通过愈伤组织途径分化出不定芽，继而得到正常生长、发育的再生植株。
关键词延龄草；愈伤组织；诱导；植株再生
中图分类号S567.23+9文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）02-135-04
Abstract [Objective]To establish the regeneration system of callus induction， proliferation and differentiation of Trilliumts chonoskii Maxim.. [Method]Tuber and root tip of Trilliumts chonoskii Maxim. were used as the explants，the composition and quality concentration ratio of plant growth regulators were designed by orthogonal experiment，the effects of plant growth regulators on callus formation， proliferation and differentiation of Trilliumts chonoskii Maxim. were studied.[Result]1/2MS was a suitable culture medium of tuber and root tip of Trilliumts chonoskii Maxim..1/2MS Medium added with 6BA 1.2 mg/L and IAA 0.6 mg/L was suitable for callus induction，the optimal examples were root tip.In medium added with 6BA 0.5 mg/L and IAA 0.6 mg/L， the differentiation rate of callus was the highest.1/2MS Medium added with 6BA 1.2 mg /L， IAA 1.0 mg /L was suitable for rooting.[Conclusion]Tubers and root tip explants of Trilliumts chonoskii Maxim.could be differentiated adventitious buds by callus pathway in suitable hormone combination，and then get the normal growth and development of plant regeneration.
Key words Trilliumts chonoskii Maxim.； Callus；Induction；Plant Regeneration
延龄草 （Trilliumts chonoskii Maxim.）别名头顶一颗珠、芋儿七，是百合科多年生草本植物，是神农架的四大名药之一[1]，生于海拔1 000～3 200 m阴湿处， 在我国主要产地是湖北省的神农架、恩施和宜昌等地。 延龄草根茎含薯蓣皂素、叶片含黄酮类化合物[2] 等有效成分， 具杀菌、止血、解毒等功效， 主治头晕目眩、高血压、神经衰弱症， 是传统名贵中药之一。
延龄草的种子休眠期长，自然繁殖系数低， 由于多年的掠夺式采挖，森林采伐过度， 破坏了林下延龄草生长的环境，使得野生的数量急剧减少，濒临灭绝边缘，已被国家列为三级保护植物[3]。延龄草种群生态位宽度非常狭小， 种群生境独特[4-5]， 异地栽培繁殖非常困难， 只能采取就地保护措施。对于延龄草的组织培养从20世纪90年代就已有报道，但成效甚微，并未成规模化培养，该研究试图探索延龄草的组织培养繁殖技术，以期为延龄草繁殖方法的改良及该药用植物的保护和利用提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
2012年9月，以延龄草（Trilliumts chonoskii Maxim.）的块根及根尖为材料进行愈伤组织诱导试验。延龄草整株采自浙江省西天目山海拔1 220 m的山坡上，带土挖取，置于塑料营养钵内带回实验室。
1.2仪器与试剂
SWCJ2FD洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；GXZ型智能培养箱（宁波东南仪器有限公司）；MLS3780高压蒸汽灭菌器（三洋电机株式会社）。植物生长调节剂萘乙酸（NAA）、6苄氨基嘌呤（6BA）、吲哚乙酸（IAA）、激动素（KT）等试验所用试剂均为国产分析纯。
1.3试验方法
1.3.1外植体消毒。将采集的健康延龄草块根先用流水冲掉表面浮土， 再用洗洁精浸泡15 min， 流水冲洗3 h后， 用吸水纸吸取所带的水分转入无菌烧杯，移入超净工作台，用9种不同的灭菌方法处理（表1）。取出材料，无菌水震荡冲洗7次。在无菌条件下，将消毒处理好的外植体块根和根尖切成0.5 cm×0.5 cm左右，每个处理5瓶，每瓶接种3个外植体，重复3次，分别接种于1/2MS培养基上。培养温度为（20±2）℃，光照强度3 100～3 400 lx，光照时间12 h/d，相对湿度控制在80%。每天观察，记录染菌情况。对试验中成活率和污染率的结果进行直观分析，确定延龄草外植体最佳灭菌方案。 1.3.2愈伤组织诱导。以1/2MS为基础培养基，附加不同激素6BA、NAA、IAA，按不同的质量浓度组合添加6BA（1.0、1.2、4.0 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0 mg/L）、 IAA（0.6、1.0、2.0 mg/L）（表2）。灭菌前将培养基pH调至6.0，常规法灭菌。将消毒好的外植体置于超净工作台上，每个处理5瓶，每瓶接种3个外植体，重复处理3次。外植体置于培养箱中培养，培养温度为（20±2）℃，光照强度3 100～3 400 lx，光照时间12 h/d，相对湿度控制在80%。每天观察诱导愈伤组织的情况。愈伤组织诱导率= 诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%。
1.3.3愈伤组织继代与增殖。
采用L9（34）正交试验设计，考虑到影响增殖的因素主要有细胞分裂素6BA和KT，生长素为IAA。试验设计中以1/2MS为基础培养基，外加30 g/L蔗糖，pH为6.0。因素水平安排如表3所示，每个处理10瓶，每瓶接种3个样，重复3次。以22 d为周期，统计增殖系数及生长状况等。增殖系数=增殖后重量/接种时重量。
1.3.4愈伤组织分化不定芽及生长。
以MS（1、1/2、1/4）、6BA（0.5、1.2、4.0 mg/L） 、IAA（0.6、1.0、2.0 mg/L）进行3因素3水平试验。每个处理10瓶，每瓶接种3个样，重复3次。以22 d为周期，观察并统计其分化生长状况。
1.3.5壮苗生根培养。
以1/2MS为基础培养基，附加不同激素6BA、IAA，按不同的质量浓度组合添加6BA（1.2、1.0、4.0 mg/L）、IAA（0.6、1.0、2.0 mg/L）。每个处理5瓶，每瓶接种3个外植体，重复处理3次，分别接种于目标培养基上。定期观测材料的生长情况，30 d后观察生根率。
2结果与分析
2.1外植体无菌培养体系的建立
延龄草块根和根尖在培养基中培养2周后，记录试验结果并统计数据。从表1可看出，延龄草块根及根尖灭菌效果最好的依次是方案3、6，块根污染率分别为2.7%、10.9%，根尖污染率分别为11.7%、9.8%；成活率最高的依次是方案3、6，块根成活率分别为97.3%、89.1%；根尖成活率分别为88.3%、95.2%。综合污染率、成活率两方面因素，方案3即用30%次氯酸钠浸泡2 min ，再用0.1%HgCl2浸泡12 min对延龄草块根的灭菌效果最好；方案6即用30%次氯酸钠浸泡4 min，再用0.1%HgCl2浸泡12 min对延龄草根尖的灭菌效果最好。
2.2不同培养基对愈伤组织诱导率的影响
以延龄草块根和根尖为外植体，研究生长调节剂对延龄草愈伤组织诱导率的影响。由表2可知，不同的激素水平组合对诱导率的影响差异较大，延龄草的块茎和根尖均能诱导出愈伤组织，对不同激素诱导产生的愈伤组织的数量、颜色和质地进行观测发现，根尖、块根在1/2MS+6BA 1.2 mg/L+IAA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L培养基上愈伤组织产量最高，其中块根诱导率为95.66%，根尖诱导率为94.44%，愈伤组织颜色为黄青色，质地致密，质量较好（图1）。根据延龄草的愈伤诱导率极差分析发现，IAA、NAA 和6BA 3因素对延龄草愈伤组织诱导的影响均不显著，但影响程度略有差异，影响最大的是6BA 因素，其次是IAA因素，影响最小的为NAA因素。
2.3愈伤组织继代与增殖培养
从表3可以看出，不同生长调节剂对增殖的影响，在6BA浓度为0.5 mg/L的培养基上，延龄草愈伤组织增殖倍数普遍较低，基本不增殖，大部分愈伤组织逐渐变白并死亡，6BA浓度在2.0 mg/L时，延龄草愈伤组织增殖倍数平均为2.34，但愈伤组织培养到20 d左右也会出现逐渐变白并死亡的现象，可见6BA的浓度对延龄草愈伤组织继代培养影响显著。
根据延龄草愈伤继代培养的极差分析（表3）发现，愈伤组织在1/2MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L IAA+7.0 g/L琼脂的培养基上的增殖效果最好，增殖数达3.99。极差值R分析结果表明，6BA、IAA、KT对增殖数的影响主次为6BA > IAA>KT。筛选出延龄草愈伤组织增殖与继代培养的配方为1/2MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7.0 g/L琼脂。
2.4不同激素对愈伤组织分化不定芽及生长的影响
将生长状况良好且基本一致的愈伤组织转移到分化培养基上，结果发现，在分化培养基中培养15 d 后，愈伤组织表面出现黄青色突起；20 d 产生芽点，30 d 长芽（图2），50 d 芽长有2～3 片叶。60 d后统计结果（表4）可见，对延龄草愈伤组织分化的最优培养基是1/2MS+IAA 0.6 mg/L+6BA 0.5 mg/L，分化率高达88.95%。极差值R分析结果表明，MS、IAA、6BA 3个因素对延龄草愈伤组织分化的影响率大小为MS基本培养基>6BA>IAA。综合分化不定芽的长势和健壮度，筛选出最佳分化培养基为1/2MS+ IAA 0.6 mg/L +6BA 0.5 mg/L +6.5 g/L琼脂+蔗糖30 g/L。
2.5不同因素对延龄草生根培养的影响
将分化不定芽接种到6种不同培养基上，30 d后统计结果得出1/2MS为最好的壮苗生根培养基（图3）。以1/2MS为基础培养基，对IAA、6BA 2种生长调节剂进行正交试验，结果（表5）发现，苗健壮和生根率高的培养基为1/2MS+IAA 1.0 mg/L+6BA 1.2 mg/L+琼脂6.8 g/L+蔗糖30 g/L。
3结论与讨论
该试验以优良延龄草野生植株块根和根尖为外植体，从
外植体灭菌开始，到愈伤组织诱导、分化不定芽，再到生根培养，成功地完成了延龄草再生体系的建立，筛选出
最适合的愈伤组织诱导培养基为1/2MS+6BA 1.2 mg/L+IAA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，且愈伤的诱导率可达95.66%。另外该研究从延龄草愈伤组织的增殖、分化、丛生苗的生根等方面对延龄草再生体系各个环节进行了较系统的研究，结果表明，延龄草的块根和根尖均可以诱导出愈伤组织，且能分化成丛生苗，但从愈伤的增殖培养过程中发现延龄草的愈伤组织培养到30 d左右会出现褐化严重的现象，愈伤组织的增殖倍数仅有3.99，对延龄草愈伤组织的增殖培养还有待进一步的研究。该研究证明组织培养是延龄草繁殖的一个有效途径，可以使延龄草野生资源得到有效保护。
参考文献
[1]
柳俊.延龄草组织培养研究[J].中国中药杂志，1998，23（9）：522-524.
[2] YOSHITAMA K，OYAMADA T，YAHARA S.Flavonoids in theleaves of Trillium undulatum Willdenow[J].Journal of plant research，1997，110（1099）：379-381.
[3] 吕晔， 袁昌齐， 王年鹤， 等.鄂西地区珍稀濒危药用植物的迁地保护研究[J].中药材，1991，14（8）：11.
[4] 胡天印，钱丽华，张宏伟.濒危植物艳玲草种群空间分布格局的研究[J].金华职业技术学院学报，2005，5（4）：87-89.
[5] 李群，王丽.濒危植物延龄草初代培养中无菌培养物的建立[J].四川师范大学学报（自然科学版），2014，37（4）：585-588.
关键词延龄草；愈伤组织；诱导；植株再生
中图分类号S567.23+9文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）02-135-04
Abstract [Objective]To establish the regeneration system of callus induction， proliferation and differentiation of Trilliumts chonoskii Maxim.. [Method]Tuber and root tip of Trilliumts chonoskii Maxim. were used as the explants，the composition and quality concentration ratio of plant growth regulators were designed by orthogonal experiment，the effects of plant growth regulators on callus formation， proliferation and differentiation of Trilliumts chonoskii Maxim. were studied.[Result]1/2MS was a suitable culture medium of tuber and root tip of Trilliumts chonoskii Maxim..1/2MS Medium added with 6BA 1.2 mg/L and IAA 0.6 mg/L was suitable for callus induction，the optimal examples were root tip.In medium added with 6BA 0.5 mg/L and IAA 0.6 mg/L， the differentiation rate of callus was the highest.1/2MS Medium added with 6BA 1.2 mg /L， IAA 1.0 mg /L was suitable for rooting.[Conclusion]Tubers and root tip explants of Trilliumts chonoskii Maxim.could be differentiated adventitious buds by callus pathway in suitable hormone combination，and then get the normal growth and development of plant regeneration.
Key words Trilliumts chonoskii Maxim.； Callus；Induction；Plant Regeneration
延龄草 （Trilliumts chonoskii Maxim.）别名头顶一颗珠、芋儿七，是百合科多年生草本植物，是神农架的四大名药之一[1]，生于海拔1 000～3 200 m阴湿处， 在我国主要产地是湖北省的神农架、恩施和宜昌等地。 延龄草根茎含薯蓣皂素、叶片含黄酮类化合物[2] 等有效成分， 具杀菌、止血、解毒等功效， 主治头晕目眩、高血压、神经衰弱症， 是传统名贵中药之一。
延龄草的种子休眠期长，自然繁殖系数低， 由于多年的掠夺式采挖，森林采伐过度， 破坏了林下延龄草生长的环境，使得野生的数量急剧减少，濒临灭绝边缘，已被国家列为三级保护植物[3]。延龄草种群生态位宽度非常狭小， 种群生境独特[4-5]， 异地栽培繁殖非常困难， 只能采取就地保护措施。对于延龄草的组织培养从20世纪90年代就已有报道，但成效甚微，并未成规模化培养，该研究试图探索延龄草的组织培养繁殖技术，以期为延龄草繁殖方法的改良及该药用植物的保护和利用提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
2012年9月，以延龄草（Trilliumts chonoskii Maxim.）的块根及根尖为材料进行愈伤组织诱导试验。延龄草整株采自浙江省西天目山海拔1 220 m的山坡上，带土挖取，置于塑料营养钵内带回实验室。
1.2仪器与试剂
SWCJ2FD洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；GXZ型智能培养箱（宁波东南仪器有限公司）；MLS3780高压蒸汽灭菌器（三洋电机株式会社）。植物生长调节剂萘乙酸（NAA）、6苄氨基嘌呤（6BA）、吲哚乙酸（IAA）、激动素（KT）等试验所用试剂均为国产分析纯。
1.3试验方法
1.3.1外植体消毒。将采集的健康延龄草块根先用流水冲掉表面浮土， 再用洗洁精浸泡15 min， 流水冲洗3 h后， 用吸水纸吸取所带的水分转入无菌烧杯，移入超净工作台，用9种不同的灭菌方法处理（表1）。取出材料，无菌水震荡冲洗7次。在无菌条件下，将消毒处理好的外植体块根和根尖切成0.5 cm×0.5 cm左右，每个处理5瓶，每瓶接种3个外植体，重复3次，分别接种于1/2MS培养基上。培养温度为（20±2）℃，光照强度3 100～3 400 lx，光照时间12 h/d，相对湿度控制在80%。每天观察，记录染菌情况。对试验中成活率和污染率的结果进行直观分析，确定延龄草外植体最佳灭菌方案。 1.3.2愈伤组织诱导。以1/2MS为基础培养基，附加不同激素6BA、NAA、IAA，按不同的质量浓度组合添加6BA（1.0、1.2、4.0 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0 mg/L）、 IAA（0.6、1.0、2.0 mg/L）（表2）。灭菌前将培养基pH调至6.0，常规法灭菌。将消毒好的外植体置于超净工作台上，每个处理5瓶，每瓶接种3个外植体，重复处理3次。外植体置于培养箱中培养，培养温度为（20±2）℃，光照强度3 100～3 400 lx，光照时间12 h/d，相对湿度控制在80%。每天观察诱导愈伤组织的情况。愈伤组织诱导率= 诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%。
1.3.3愈伤组织继代与增殖。
采用L9（34）正交试验设计，考虑到影响增殖的因素主要有细胞分裂素6BA和KT，生长素为IAA。试验设计中以1/2MS为基础培养基，外加30 g/L蔗糖，pH为6.0。因素水平安排如表3所示，每个处理10瓶，每瓶接种3个样，重复3次。以22 d为周期，统计增殖系数及生长状况等。增殖系数=增殖后重量/接种时重量。
1.3.4愈伤组织分化不定芽及生长。
以MS（1、1/2、1/4）、6BA（0.5、1.2、4.0 mg/L） 、IAA（0.6、1.0、2.0 mg/L）进行3因素3水平试验。每个处理10瓶，每瓶接种3个样，重复3次。以22 d为周期，观察并统计其分化生长状况。
1.3.5壮苗生根培养。
以1/2MS为基础培养基，附加不同激素6BA、IAA，按不同的质量浓度组合添加6BA（1.2、1.0、4.0 mg/L）、IAA（0.6、1.0、2.0 mg/L）。每个处理5瓶，每瓶接种3个外植体，重复处理3次，分别接种于目标培养基上。定期观测材料的生长情况，30 d后观察生根率。
2结果与分析
2.1外植体无菌培养体系的建立
延龄草块根和根尖在培养基中培养2周后，记录试验结果并统计数据。从表1可看出，延龄草块根及根尖灭菌效果最好的依次是方案3、6，块根污染率分别为2.7%、10.9%，根尖污染率分别为11.7%、9.8%；成活率最高的依次是方案3、6，块根成活率分别为97.3%、89.1%；根尖成活率分别为88.3%、95.2%。综合污染率、成活率两方面因素，方案3即用30%次氯酸钠浸泡2 min ，再用0.1%HgCl2浸泡12 min对延龄草块根的灭菌效果最好；方案6即用30%次氯酸钠浸泡4 min，再用0.1%HgCl2浸泡12 min对延龄草根尖的灭菌效果最好。
2.2不同培养基对愈伤组织诱导率的影响
以延龄草块根和根尖为外植体，研究生长调节剂对延龄草愈伤组织诱导率的影响。由表2可知，不同的激素水平组合对诱导率的影响差异较大，延龄草的块茎和根尖均能诱导出愈伤组织，对不同激素诱导产生的愈伤组织的数量、颜色和质地进行观测发现，根尖、块根在1/2MS+6BA 1.2 mg/L+IAA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L培养基上愈伤组织产量最高，其中块根诱导率为95.66%，根尖诱导率为94.44%，愈伤组织颜色为黄青色，质地致密，质量较好（图1）。根据延龄草的愈伤诱导率极差分析发现，IAA、NAA 和6BA 3因素对延龄草愈伤组织诱导的影响均不显著，但影响程度略有差异，影响最大的是6BA 因素，其次是IAA因素，影响最小的为NAA因素。
2.3愈伤组织继代与增殖培养
从表3可以看出，不同生长调节剂对增殖的影响，在6BA浓度为0.5 mg/L的培养基上，延龄草愈伤组织增殖倍数普遍较低，基本不增殖，大部分愈伤组织逐渐变白并死亡，6BA浓度在2.0 mg/L时，延龄草愈伤组织增殖倍数平均为2.34，但愈伤组织培养到20 d左右也会出现逐渐变白并死亡的现象，可见6BA的浓度对延龄草愈伤组织继代培养影响显著。
根据延龄草愈伤继代培养的极差分析（表3）发现，愈伤组织在1/2MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L IAA+7.0 g/L琼脂的培养基上的增殖效果最好，增殖数达3.99。极差值R分析结果表明，6BA、IAA、KT对增殖数的影响主次为6BA > IAA>KT。筛选出延龄草愈伤组织增殖与继代培养的配方为1/2MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7.0 g/L琼脂。
2.4不同激素对愈伤组织分化不定芽及生长的影响
将生长状况良好且基本一致的愈伤组织转移到分化培养基上，结果发现，在分化培养基中培养15 d 后，愈伤组织表面出现黄青色突起；20 d 产生芽点，30 d 长芽（图2），50 d 芽长有2～3 片叶。60 d后统计结果（表4）可见，对延龄草愈伤组织分化的最优培养基是1/2MS+IAA 0.6 mg/L+6BA 0.5 mg/L，分化率高达88.95%。极差值R分析结果表明，MS、IAA、6BA 3个因素对延龄草愈伤组织分化的影响率大小为MS基本培养基>6BA>IAA。综合分化不定芽的长势和健壮度，筛选出最佳分化培养基为1/2MS+ IAA 0.6 mg/L +6BA 0.5 mg/L +6.5 g/L琼脂+蔗糖30 g/L。
2.5不同因素对延龄草生根培养的影响
将分化不定芽接种到6种不同培养基上，30 d后统计结果得出1/2MS为最好的壮苗生根培养基（图3）。以1/2MS为基础培养基，对IAA、6BA 2种生长调节剂进行正交试验，结果（表5）发现，苗健壮和生根率高的培养基为1/2MS+IAA 1.0 mg/L+6BA 1.2 mg/L+琼脂6.8 g/L+蔗糖30 g/L。
3结论与讨论
该试验以优良延龄草野生植株块根和根尖为外植体，从
外植体灭菌开始，到愈伤组织诱导、分化不定芽，再到生根培养，成功地完成了延龄草再生体系的建立，筛选出
最适合的愈伤组织诱导培养基为1/2MS+6BA 1.2 mg/L+IAA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，且愈伤的诱导率可达95.66%。另外该研究从延龄草愈伤组织的增殖、分化、丛生苗的生根等方面对延龄草再生体系各个环节进行了较系统的研究，结果表明，延龄草的块根和根尖均可以诱导出愈伤组织，且能分化成丛生苗，但从愈伤的增殖培养过程中发现延龄草的愈伤组织培养到30 d左右会出现褐化严重的现象，愈伤组织的增殖倍数仅有3.99，对延龄草愈伤组织的增殖培养还有待进一步的研究。该研究证明组织培养是延龄草繁殖的一个有效途径，可以使延龄草野生资源得到有效保护。
参考文献
[1]
柳俊.延龄草组织培养研究[J].中国中药杂志，1998，23（9）：522-524.
[2] YOSHITAMA K，OYAMADA T，YAHARA S.Flavonoids in theleaves of Trillium undulatum Willdenow[J].Journal of plant research，1997，110（1099）：379-381.
[3] 吕晔， 袁昌齐， 王年鹤， 等.鄂西地区珍稀濒危药用植物的迁地保护研究[J].中药材，1991，14（8）：11.
[4] 胡天印，钱丽华，张宏伟.濒危植物艳玲草种群空间分布格局的研究[J].金华职业技术学院学报，2005，5（4）：87-89.
[5] 李群，王丽.濒危植物延龄草初代培养中无菌培养物的建立[J].四川师范大学学报（自然科学版），2014，37（4）：585-588.