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【摘要】 目的：对FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA对肺结核诊断的应用进行研究。方法：随机选取2013年12月-2014年11月期间本院收治的肺结核患者110例作为本次研究的对象，所有患者实施纤支镜检查、活检、刷检，BALF中结核杆菌-DNA行FQ-PCR检测，对检查结果进行分析研究。结果：在本次研究中，确诊为肺结核的患者有40.00%（44/110）；FQ-PC检测的敏感性明显高于常规涂片镜检，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：在肺结核的诊断中，FQ-PCR检测的敏感度高，操作简单方便，检测速度较快，是BALF中结核杆菌-DNA检查的重要方法，在肺结核的诊断中有重要的应用价值。
【关键词】 FQ-PCR检测； BALF； 结核杆菌-DNA； 肺结核诊断
The Application of Mycobacterium Tuberculosis-DNA in BALF by FQ-PCR for the Diagnosis of Pulmonary/TONG Jian-lin，RAO Chang-hong，HUANG Bo.//Medical Innovation of China，2015，12（26）：066-067
【Abstract】 Objective：To study the application of mycobacterium tuberculosis-DNA in BALF by FQ-PCR for the diagnosis of pulmonary.Method：110 cases with tuberculosis in our hospital were randomly selected from December 2013 to November 2014 as the objects of the study， all patients were given the fiberoptic bronchoscopy， biopsy， brush biopsy，mycobacterium tuberculosis DNA in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was detected by FQ-PCR，the examination results were analyzed. Result： In this study，44 cases of pulmonary tuberculosis， accounted for the proportion to 40.00%（44/110）；the sensitivity of FQ-PC detection was significantly higher than that of conventional smear microscopy，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：In the diagnosis of pulmonary tuberculosis，the FQ-PCR detection has high sensitivity， simple operation and the detection speed faster，it is an important examination method of mycobacterium tuberculosis DNA in BALF and has important application value.
【Key words】 FQ-PCR detection； Bronchoalveolar lavage fluid； Mycobacterium tuberculosis-DNA； Tuberculosis diagnosis
First-author’s address：Affiliated Hospital of Jiujiang University，Jiujiang 332000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.26.020
本文通過FQ-PCR检测BALF（Bronchoalveolar lavage fluid）中结核杆菌-DNA对肺结核的诊断进行分析研究，具体如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机选取2013年12月-2014年11月期间本院收治的肺结核患者110例作为本次研究的对象，其中男67例，女43例，年龄17～68岁，平均（43.5±2.2）岁。所有患者临床诊断表现为胸片或胸部CT检查显示肺部有病变，肺部单侧或双侧有斑块状或片状阴影、结节等[1-2]。所有患者自愿参与本次研究，且签订了知情同意书。
1.2 方法 所有患者均实施纤支镜检查、活检、刷检，BALF中结核杆菌-DNA等检查，且在这些检查之前，对患者实施血常规、血凝四项等检查[3]。检查中使用到的设备、仪器主要有：纤支镜型号为PENTAX，PCR扩增仪由美国PE公司提供；荧光检测仪（DA7600）、DNA提取液、TaG-DNA酶、荧光标记引物、定量标准品（TB-DNA浓度：106基因拷贝/μL）由中山医科大学达安基因诊断中心提供。检查步骤如下：（1）支气管镜检查：按照支气管镜仪器使用说明书，进行相关的操作检查，并让患者做好相关的检查前准备，参照患者的X线检查、CT检查结果，在支气管镜下对患者的肺部进行观察，如果有可以进行活检的病灶，则使用活检钳在病灶上取下3～5块的组织，使用10%福尔马林固定后进行病理检验。一次性细胞刷对病变部位进行涂片、抗酸染色、细胞学检查，生理盐水支气管灌洗，收集灌洗液，进行BALF结核杆菌DNA检查[4-5]。如果在支气管镜下没有发现可以进行活检的病灶，需要根据患者的病变位置，刷检后再进行灌洗。（2）BALF结核杆菌DNA检查处理：取灌洗液1～1.5 mL，在转速为12 000 r/min的离心机中离心5 min；取沉淀物，加入无菌生理盐水1 mL，振荡混匀，然后在转速12 000 r/min的离心机中离心5 min；取沉淀物，加入50 mL DNA提取液混匀，在100 ℃恒温下处理10 min；然后在4 ℃冰箱中冷却至室温后，再进行12 000 r/min离心5 min，取上清液2μL加入PCR反应管，8000 r/min离心数秒，然后将反应管取出放入PCR仪，在PCR反应后行荧光FQ-PCR检测，记录读数。取灌洗液5 mL，离心、沉淀、涂片，进行细胞学检查。支气管镜无菌盐水冲洗后，取冲洗液于无菌瓶中，进行荧光定量检查。本次研究中，所有的实验室检查步骤中，使用到的试剂均为相应的检查仪器配套试剂，仪器的操作需要严格的按照操作说明书进行。 1.3 观察指标 针对本次研究中各种检查方法下的结核杆菌-DNA阳性率进行观察分析。
1.4 统计学处理 使用统计学软件SPSS 15.0进行处理分析，计量资料采用（x±s）表示，计数资料采用 字2检验、Wilcoxon检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 荧光FQ-PCR检测与金标准结果比较 本次研究中确诊为肺结核的患者有44例，所占的比例为40.00%（44/110）。荧光定量FQ-PCR检测的BALF肺结核的敏感度为63.64%，特异度为96.97%，准确度为83.64%。阳性预测值=93.33%，阴性预测值=80.00%，阳性似然比=21.00，阴性似然比=0.37。FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA结果与金标准比较见表1。
2.2 三种肺结核诊断结果比较 FQ-PCR检测的敏感性明显高于痰涂片、刷检涂片，三种方法诊断肺结核的敏感性比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。随机20次对清洗后的支气管镜用无菌生理盐水冲洗，冲洗液实时荧光定量PCR检测结果为全阴性。
3 讨论
在肺结核的临床诊断中，实验室检查是重要的手段，通过实验室检查，可以将肺结核疾病的传染源进行明确。传统的涂片检查，操作简单、快速，但是其检验的准确性较差[6]。随着临床检验技术的发展和进步，FQ-PCR检验技术产生，因其具有精确、简便、快速等优点，所以在临床检验中被广泛的应用[7]。本文FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA对肺结核的诊断进行了分析研究，结果显示FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA的阳性率明显的高于涂片、刷检[8-9]。
在本次研究中荧光定量FQ-PCR检测的BALF肺结核的敏感度为63.64%，特异度为96.97%，准确度为83.64%。阳性预测值=93.33%；阴性预测值=80.00%；阳性似然比=21.00；阴性似然比=0.37，显著优于其他检验方法的检查结果。FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA的整个检验过程密闭进行，实现了实时动态监测，有效地减少了检验中的污染，减少了假阳性、假阴性的发生，其临床诊断准确性较高。在肺结核的诊断中，FQ-PCR检测方法的应用自动化程度较高，可以进行定性定量检查，有较高的准确性、特异性和灵敏性，结合本次研究的结果，FQ-PCR检测在肺结核的诊断中有较高的应用价值，可以进行推广应用[10-12]。
参考文献
[1]陈效友.肺结核诊断的研究进展[J].中国临床医生，2013，42（3）：11-14.
[2]雷艷萍，雷金燕.经纤维支气管镜诊断与治疗肺结核并反复发作性肺炎的临床观察[J].中国医学创新，2010，7（8）：32-34.
[3]雷云.荧光PCR诊断肺结核的临床应用研究[J].临床肺科杂志，2014，19（7）：1278-1280.
[4]张艳.三种支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测方法在菌阴肺结核诊断中的应用研究[J].中国医学创新，2011，8（18）：116-117.
[5]吴国兰，陈晓红，李学玲，等.4种不同支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测方法在肺结核诊断中的应用研究[J].中国临床医生，2013，42（3）：39-41.
[6]宋予娟.FQ-PCR法痰结核杆菌DNA检测及其临床应用[J].中国实用医药，2014，9（36）：43-44.
[7]黄泽亮，桂福.FQ-PCR检查痰中结核杆菌对肺结核诊断的临床价值[J].中南医学科学杂志，2013，41（4）：389-391.
[8]杨洪毅，石洁，刘国栋，等.荧光定量PCR技术在痰结核菌检测中的应用[J].现代预防医学，2013，40（8）：1483-1484.
[9]张宏英，陈力舟，林敏，等.痰与支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌FQ-PCR检测对涂阴肺结核诊断价值的比较[J].中国防痨杂志，2011，33（12）：806-809.
[10]金建东.荧光定量PCR检测痰结核杆菌DNA及其临床应用[J].齐齐哈尔医学院学报，2010，31（22）：3565-3566.
[11]刘小文，欧阳冬英.实时荧光定量PCR检测痰中结核分枝杆菌临床评价[J].中国现代医药杂志，2014，16（1）：24-26.
[12]李群，张恒.核酸扩增检测结核杆菌DNA方法在肺结核诊断中的临床价值[J].疾病监测与控制，2013，7（8）：457-459.
（收稿日期：2015-06-15） （本文编辑：周亚杰）
【关键词】 FQ-PCR检测； BALF； 结核杆菌-DNA； 肺结核诊断
The Application of Mycobacterium Tuberculosis-DNA in BALF by FQ-PCR for the Diagnosis of Pulmonary/TONG Jian-lin，RAO Chang-hong，HUANG Bo.//Medical Innovation of China，2015，12（26）：066-067
【Abstract】 Objective：To study the application of mycobacterium tuberculosis-DNA in BALF by FQ-PCR for the diagnosis of pulmonary.Method：110 cases with tuberculosis in our hospital were randomly selected from December 2013 to November 2014 as the objects of the study， all patients were given the fiberoptic bronchoscopy， biopsy， brush biopsy，mycobacterium tuberculosis DNA in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was detected by FQ-PCR，the examination results were analyzed. Result： In this study，44 cases of pulmonary tuberculosis， accounted for the proportion to 40.00%（44/110）；the sensitivity of FQ-PC detection was significantly higher than that of conventional smear microscopy，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：In the diagnosis of pulmonary tuberculosis，the FQ-PCR detection has high sensitivity， simple operation and the detection speed faster，it is an important examination method of mycobacterium tuberculosis DNA in BALF and has important application value.
【Key words】 FQ-PCR detection； Bronchoalveolar lavage fluid； Mycobacterium tuberculosis-DNA； Tuberculosis diagnosis
First-author’s address：Affiliated Hospital of Jiujiang University，Jiujiang 332000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.26.020
本文通過FQ-PCR检测BALF（Bronchoalveolar lavage fluid）中结核杆菌-DNA对肺结核的诊断进行分析研究，具体如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机选取2013年12月-2014年11月期间本院收治的肺结核患者110例作为本次研究的对象，其中男67例，女43例，年龄17～68岁，平均（43.5±2.2）岁。所有患者临床诊断表现为胸片或胸部CT检查显示肺部有病变，肺部单侧或双侧有斑块状或片状阴影、结节等[1-2]。所有患者自愿参与本次研究，且签订了知情同意书。
1.2 方法 所有患者均实施纤支镜检查、活检、刷检，BALF中结核杆菌-DNA等检查，且在这些检查之前，对患者实施血常规、血凝四项等检查[3]。检查中使用到的设备、仪器主要有：纤支镜型号为PENTAX，PCR扩增仪由美国PE公司提供；荧光检测仪（DA7600）、DNA提取液、TaG-DNA酶、荧光标记引物、定量标准品（TB-DNA浓度：106基因拷贝/μL）由中山医科大学达安基因诊断中心提供。检查步骤如下：（1）支气管镜检查：按照支气管镜仪器使用说明书，进行相关的操作检查，并让患者做好相关的检查前准备，参照患者的X线检查、CT检查结果，在支气管镜下对患者的肺部进行观察，如果有可以进行活检的病灶，则使用活检钳在病灶上取下3～5块的组织，使用10%福尔马林固定后进行病理检验。一次性细胞刷对病变部位进行涂片、抗酸染色、细胞学检查，生理盐水支气管灌洗，收集灌洗液，进行BALF结核杆菌DNA检查[4-5]。如果在支气管镜下没有发现可以进行活检的病灶，需要根据患者的病变位置，刷检后再进行灌洗。（2）BALF结核杆菌DNA检查处理：取灌洗液1～1.5 mL，在转速为12 000 r/min的离心机中离心5 min；取沉淀物，加入无菌生理盐水1 mL，振荡混匀，然后在转速12 000 r/min的离心机中离心5 min；取沉淀物，加入50 mL DNA提取液混匀，在100 ℃恒温下处理10 min；然后在4 ℃冰箱中冷却至室温后，再进行12 000 r/min离心5 min，取上清液2μL加入PCR反应管，8000 r/min离心数秒，然后将反应管取出放入PCR仪，在PCR反应后行荧光FQ-PCR检测，记录读数。取灌洗液5 mL，离心、沉淀、涂片，进行细胞学检查。支气管镜无菌盐水冲洗后，取冲洗液于无菌瓶中，进行荧光定量检查。本次研究中，所有的实验室检查步骤中，使用到的试剂均为相应的检查仪器配套试剂，仪器的操作需要严格的按照操作说明书进行。 1.3 观察指标 针对本次研究中各种检查方法下的结核杆菌-DNA阳性率进行观察分析。
1.4 统计学处理 使用统计学软件SPSS 15.0进行处理分析，计量资料采用（x±s）表示，计数资料采用 字2检验、Wilcoxon检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 荧光FQ-PCR检测与金标准结果比较 本次研究中确诊为肺结核的患者有44例，所占的比例为40.00%（44/110）。荧光定量FQ-PCR检测的BALF肺结核的敏感度为63.64%，特异度为96.97%，准确度为83.64%。阳性预测值=93.33%，阴性预测值=80.00%，阳性似然比=21.00，阴性似然比=0.37。FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA结果与金标准比较见表1。
2.2 三种肺结核诊断结果比较 FQ-PCR检测的敏感性明显高于痰涂片、刷检涂片，三种方法诊断肺结核的敏感性比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。随机20次对清洗后的支气管镜用无菌生理盐水冲洗，冲洗液实时荧光定量PCR检测结果为全阴性。
3 讨论
在肺结核的临床诊断中，实验室检查是重要的手段，通过实验室检查，可以将肺结核疾病的传染源进行明确。传统的涂片检查，操作简单、快速，但是其检验的准确性较差[6]。随着临床检验技术的发展和进步，FQ-PCR检验技术产生，因其具有精确、简便、快速等优点，所以在临床检验中被广泛的应用[7]。本文FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA对肺结核的诊断进行了分析研究，结果显示FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA的阳性率明显的高于涂片、刷检[8-9]。
在本次研究中荧光定量FQ-PCR检测的BALF肺结核的敏感度为63.64%，特异度为96.97%，准确度为83.64%。阳性预测值=93.33%；阴性预测值=80.00%；阳性似然比=21.00；阴性似然比=0.37，显著优于其他检验方法的检查结果。FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA的整个检验过程密闭进行，实现了实时动态监测，有效地减少了检验中的污染，减少了假阳性、假阴性的发生，其临床诊断准确性较高。在肺结核的诊断中，FQ-PCR检测方法的应用自动化程度较高，可以进行定性定量检查，有较高的准确性、特异性和灵敏性，结合本次研究的结果，FQ-PCR检测在肺结核的诊断中有较高的应用价值，可以进行推广应用[10-12]。
参考文献
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[3]雷云.荧光PCR诊断肺结核的临床应用研究[J].临床肺科杂志，2014，19（7）：1278-1280.
[4]张艳.三种支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测方法在菌阴肺结核诊断中的应用研究[J].中国医学创新，2011，8（18）：116-117.
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[6]宋予娟.FQ-PCR法痰结核杆菌DNA检测及其临床应用[J].中国实用医药，2014，9（36）：43-44.
[7]黄泽亮，桂福.FQ-PCR检查痰中结核杆菌对肺结核诊断的临床价值[J].中南医学科学杂志，2013，41（4）：389-391.
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[12]李群，张恒.核酸扩增检测结核杆菌DNA方法在肺结核诊断中的临床价值[J].疾病监测与控制，2013，7（8）：457-459.
（收稿日期：2015-06-15） （本文编辑：周亚杰）