【摘 要】
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目的 拟构建双顺反子增强型绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)真核表达载体,为其在真核细胞体内外示踪定位打下基础.方法 以重组质粒
【机 构】
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天津医院脊柱外科,武警医学院病理教研室
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目的 拟构建双顺反子增强型绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)真核表达载体,为其在真核细胞体内外示踪定位打下基础.方法 以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法获得BMP2片段,将其分别与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定.将质粒转染CHO细胞后Western Blot检测BMP2蛋白表达,用RT-PCR检测BMP2mRNA表达.结果 琼脂糖电泳显示PCR产物为一条长约1216 bp的带,重组表达载体pSELECT-GFP zeo-hBMP2经双酶切可得到约1216 bp的片段,测序证实与Genebank中hBMP2序列完全相符,重组表达载体脂质体法转染CHO细胞48～72 h后荧光显微镜下证实转染成功,经RT-PCR证实CHO细胞中存在BMP2基因表达,采用免疫荧光化学方法证实载体中CHO细胞表达BMP2蛋白.经Western Blotting鉴定重组蛋白为分泌蛋白,相对分子质量在17×103左右.结论 成功构建可体内外示踪增强含双顺反子绿色荧光蛋白人BMP2真核表达载体.
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