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摘 要：随着生物技术的发展，用植物细胞培养生产重组蛋白得到了快速发展。这种技术集合了微生物发酵速度快、动物细胞培养的产物种类多等优点，也因此在近几年这类技术得到了广泛的关注。本文就用植物细胞进行培养重组的优势、原则、现状等问题对植物细胞的培养生产重组蛋白做简单的论述。
关键词：植物细胞；培养生产；重组蛋白
20世纪初植物细胞的培养开始受到关注，之后的30年植物细胞培养得到了快速的发展，其中包括植物器官的组织、原生质体以及植株的培养等。植物细胞的培养主要应用在快速繁殖、有用物质的生产、和植物细胞的遗传等方面。但植物细胞的培養技术应用在培养重组蛋白的生产方面确是在近20年才发展来的。
1 植物细胞培养生产重组蛋白的原则
1.1 选择宿主细胞
发根、固定细胞、肿瘤状物以及悬浮细胞的培养是植物细胞培养的主要方法，现在选择宿主细胞主要从拟南芥、烟草、紫衫、番茄、水稻和大豆等作物中进行选择。但是研究表示：番茄、水稻、大豆本身可以用来食用、有良好的可调控性，表达水平也比较高而且能有效的分泌蛋白[1]。因此，即便烟草中含有的细胞更容易繁殖和生长但仍没有可作为食物来用的水稻、大豆和番茄等作物更适合宿主细胞。
1.2 构建重组蛋白
构建重组蛋白在植物细胞培养生产重组蛋白中也占据了非常重要的位置，它能够决定重组蛋白的产量，因此在构建重组蛋白时一定要注意两点：一点是构建前导肽，另一点是选择启动子。首先，前导肽的好坏对重组蛋白的分泌有直接的影响，比如说：如果蛋白质的分子量不能达到30kDa，那么这种蛋白质在一般情况下都会分泌在植物悬浮细胞的培养液中。反之，某些大分子量的蛋白质则会留在细胞内。其次，启动子对重组蛋白的产量也有很大的影响。因为，启动子能够决定转录水平的高低，而转录水平又对重组蛋白的产量有很大的影响，因此启动子的好坏能够决定重组蛋白的产量的多少。
1.3 植物悬浮细胞
植物悬浮细胞的生长速率和生物细胞的生长速率相差非常的大，并且它们是生长曲线也完全不一样，但这并不代表植物悬浮细胞不可以用生物细胞的生长方式进行繁殖，相反植物悬浮细胞仍可以按照生物发酵的方式进行生长繁殖。在1992年Nagata的报道中，烟草细胞的悬浮细胞生长速率是0.044/小时，此外，植物细胞培养速率与细菌的摄氧速率有很大的差距，但是当传统的发酵方式经过了修改整理之后，植物悬浮细胞就又能够通过发酵的方式进行生长和繁殖了。
2 重组蛋白的分离提纯
每种生物制品在生产过程当中都不能缺少下游过程，所谓的下游过程就是将重组蛋白进行进行分离和提纯的过程，这个过程对于重组细胞的产量来讲有着极为重要的作用。蛋白质的分离提纯过程是一种同中有异的过程，因为虽然每一种蛋白都有自己独特的分离提纯过程，但在这些看似毫不相同的过程当中仍然有一些相同的标准和步骤是一致的。比如说：在临床的应用过程中对重组蛋白有很高的要求，但是如果重组蛋白用于一般的用处，则对它的要求就不会像对临床应用的一样高。一般的重组蛋白在分离纯化时有以下几种方法：
首先，要确定植物细胞的生长曲线，然后用分层技术分离提纯目的蛋白。这个过程的出产物体积相对来讲比较大，所以如果能够用层析技术来提纯所需要的蛋白，那么产物就会被尽可能的压缩[2]。这是在重组蛋白是分泌蛋白的情况下，那么如果重组蛋白是胞内蛋白呢？当重组蛋白是胞内蛋白时，它与重组蛋白是分泌蛋白的分离过程和相近。先经过过滤将悬浮细胞过滤出来，然后将细胞壁和细胞核进行破碎处理，紧接着是抽提，最后运用层析技术对目的蛋白提纯。
3 植物细胞培养生产重组蛋白存在的问题
3.1 生产时重组蛋白不稳定
重组蛋白稳定与否对于植物细胞的培养生产过程来讲有着极为重要的作用，但在植物细胞的培养生产过程当中重组蛋白的稳定性问题却是一个难度非常大的课题。也因此到目前为止，能够符合GMP生产标准的宿主细胞株的特性库仍然没有被研发出来。建立宿主细胞株特性库是在工业生产过程当中不可或缺的一项重要因素，原因是生产的起始原料与生产过程的具体路线是由它所限定的，除此之外重组蛋白是否能达到一致性和稳定性也由它所决定。因此重组蛋白的稳定性对于植物细胞的生产和培养有着很大的作用。
3.2 外源基因逃逸现象
植物基因组的DNA和稳定整合在植物基因组里的外源DNA基本上一块参与了所有的遗传学行为，所以，这些外源DNA在很大程度上有随着植物细胞培养过程引起基因的沉默或是向环境中漂移的可能性。当外源基因沉默或是漂移之后，目的重组蛋白的产量就会随之下降。
4 用植物细胞进行培养重组的益处
植物细胞培养生产重组蛋白集合了动物细胞培养、微生物发酵以及完整植株培养等诸多优点。植物悬浮细胞可以在不需要特殊处理的培养基中生长也可以合成复杂的糖蛋白和多聚体蛋白，比如：白细胞介素与免疫球蛋白，它们不仅不会产生内毒素而且也不会携带人类的病原菌；不仅如此，它还可以像完整植株的培养系统一样进行翻译后的糖基化以及转入后的修饰。据2004年Gomord的报道：植物蛋白培养的重组人体糖蛋白比用其他物质合成的重组人体糖蛋白更相似于天然人体糖蛋白。而且，植物细胞培养生产重组蛋白不会受到土壤、气候以及季节等因素的影响，更重要的是，当目的重组蛋白能够分泌在悬浮细胞培养液中时，它还具有简单易行的产物分离提纯过程。
5 小结
随着生物技术以及基因工程的飞速发展，植物细胞培养和生产重组蛋白得到了越累越多专业人士的重视。但是怎样按照GMP的要求建立起宿主细胞的特性库以及怎样解决植物细胞在培养过程中出现的一系列问题对于现如今的生物学界来讲仍然是一些难以解决但又急需得到突破的一些问题。用植物细胞培养生产重组蛋白这一课题想要得到质的飞跃，那么生物界现如今面临的问题不仅要解决还要有进展。
参考文献
[1]张晓勇，王海林，高向阳，等.植物细胞培养生产重组蛋白[N].生物技术通报，2015，（6）：43-45.
[2]孙国凤.用植物细胞生产重组蛋白[N].生物技术通报，2013，（1）：8-9.
（作者单位：哈药集团生物工程有限公司原液车间真核工段）
关键词：植物细胞；培养生产；重组蛋白
20世纪初植物细胞的培养开始受到关注，之后的30年植物细胞培养得到了快速的发展，其中包括植物器官的组织、原生质体以及植株的培养等。植物细胞的培养主要应用在快速繁殖、有用物质的生产、和植物细胞的遗传等方面。但植物细胞的培養技术应用在培养重组蛋白的生产方面确是在近20年才发展来的。
1 植物细胞培养生产重组蛋白的原则
1.1 选择宿主细胞
发根、固定细胞、肿瘤状物以及悬浮细胞的培养是植物细胞培养的主要方法，现在选择宿主细胞主要从拟南芥、烟草、紫衫、番茄、水稻和大豆等作物中进行选择。但是研究表示：番茄、水稻、大豆本身可以用来食用、有良好的可调控性，表达水平也比较高而且能有效的分泌蛋白[1]。因此，即便烟草中含有的细胞更容易繁殖和生长但仍没有可作为食物来用的水稻、大豆和番茄等作物更适合宿主细胞。
1.2 构建重组蛋白
构建重组蛋白在植物细胞培养生产重组蛋白中也占据了非常重要的位置，它能够决定重组蛋白的产量，因此在构建重组蛋白时一定要注意两点：一点是构建前导肽，另一点是选择启动子。首先，前导肽的好坏对重组蛋白的分泌有直接的影响，比如说：如果蛋白质的分子量不能达到30kDa，那么这种蛋白质在一般情况下都会分泌在植物悬浮细胞的培养液中。反之，某些大分子量的蛋白质则会留在细胞内。其次，启动子对重组蛋白的产量也有很大的影响。因为，启动子能够决定转录水平的高低，而转录水平又对重组蛋白的产量有很大的影响，因此启动子的好坏能够决定重组蛋白的产量的多少。
1.3 植物悬浮细胞
植物悬浮细胞的生长速率和生物细胞的生长速率相差非常的大，并且它们是生长曲线也完全不一样，但这并不代表植物悬浮细胞不可以用生物细胞的生长方式进行繁殖，相反植物悬浮细胞仍可以按照生物发酵的方式进行生长繁殖。在1992年Nagata的报道中，烟草细胞的悬浮细胞生长速率是0.044/小时，此外，植物细胞培养速率与细菌的摄氧速率有很大的差距，但是当传统的发酵方式经过了修改整理之后，植物悬浮细胞就又能够通过发酵的方式进行生长和繁殖了。
2 重组蛋白的分离提纯
每种生物制品在生产过程当中都不能缺少下游过程，所谓的下游过程就是将重组蛋白进行进行分离和提纯的过程，这个过程对于重组细胞的产量来讲有着极为重要的作用。蛋白质的分离提纯过程是一种同中有异的过程，因为虽然每一种蛋白都有自己独特的分离提纯过程，但在这些看似毫不相同的过程当中仍然有一些相同的标准和步骤是一致的。比如说：在临床的应用过程中对重组蛋白有很高的要求，但是如果重组蛋白用于一般的用处，则对它的要求就不会像对临床应用的一样高。一般的重组蛋白在分离纯化时有以下几种方法：
首先，要确定植物细胞的生长曲线，然后用分层技术分离提纯目的蛋白。这个过程的出产物体积相对来讲比较大，所以如果能够用层析技术来提纯所需要的蛋白，那么产物就会被尽可能的压缩[2]。这是在重组蛋白是分泌蛋白的情况下，那么如果重组蛋白是胞内蛋白呢？当重组蛋白是胞内蛋白时，它与重组蛋白是分泌蛋白的分离过程和相近。先经过过滤将悬浮细胞过滤出来，然后将细胞壁和细胞核进行破碎处理，紧接着是抽提，最后运用层析技术对目的蛋白提纯。
3 植物细胞培养生产重组蛋白存在的问题
3.1 生产时重组蛋白不稳定
重组蛋白稳定与否对于植物细胞的培养生产过程来讲有着极为重要的作用，但在植物细胞的培养生产过程当中重组蛋白的稳定性问题却是一个难度非常大的课题。也因此到目前为止，能够符合GMP生产标准的宿主细胞株的特性库仍然没有被研发出来。建立宿主细胞株特性库是在工业生产过程当中不可或缺的一项重要因素，原因是生产的起始原料与生产过程的具体路线是由它所限定的，除此之外重组蛋白是否能达到一致性和稳定性也由它所决定。因此重组蛋白的稳定性对于植物细胞的生产和培养有着很大的作用。
3.2 外源基因逃逸现象
植物基因组的DNA和稳定整合在植物基因组里的外源DNA基本上一块参与了所有的遗传学行为，所以，这些外源DNA在很大程度上有随着植物细胞培养过程引起基因的沉默或是向环境中漂移的可能性。当外源基因沉默或是漂移之后，目的重组蛋白的产量就会随之下降。
4 用植物细胞进行培养重组的益处
植物细胞培养生产重组蛋白集合了动物细胞培养、微生物发酵以及完整植株培养等诸多优点。植物悬浮细胞可以在不需要特殊处理的培养基中生长也可以合成复杂的糖蛋白和多聚体蛋白，比如：白细胞介素与免疫球蛋白，它们不仅不会产生内毒素而且也不会携带人类的病原菌；不仅如此，它还可以像完整植株的培养系统一样进行翻译后的糖基化以及转入后的修饰。据2004年Gomord的报道：植物蛋白培养的重组人体糖蛋白比用其他物质合成的重组人体糖蛋白更相似于天然人体糖蛋白。而且，植物细胞培养生产重组蛋白不会受到土壤、气候以及季节等因素的影响，更重要的是，当目的重组蛋白能够分泌在悬浮细胞培养液中时，它还具有简单易行的产物分离提纯过程。
5 小结
随着生物技术以及基因工程的飞速发展，植物细胞培养和生产重组蛋白得到了越累越多专业人士的重视。但是怎样按照GMP的要求建立起宿主细胞的特性库以及怎样解决植物细胞在培养过程中出现的一系列问题对于现如今的生物学界来讲仍然是一些难以解决但又急需得到突破的一些问题。用植物细胞培养生产重组蛋白这一课题想要得到质的飞跃，那么生物界现如今面临的问题不仅要解决还要有进展。
参考文献
[1]张晓勇，王海林，高向阳，等.植物细胞培养生产重组蛋白[N].生物技术通报，2015，（6）：43-45.
[2]孙国凤.用植物细胞生产重组蛋白[N].生物技术通报，2013，（1）：8-9.
（作者单位：哈药集团生物工程有限公司原液车间真核工段）