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摘 要：该文以“新葡7号”的胚珠为试材，研究不同培养基、不同IBA浓度和胚处理方式对“新葡7号”葡萄的胚发育的影响。结果表明，在供试的3种培养基中，以Nitsch最适宜于“新葡7号”的胚珠发育，ER培养基次之，IBA最适宜浓度为1.0mg/L。最终确定开花后30d为“新葡7号”最佳取样时间，最佳胚珠发育体系为Nitsch培养基+IBA 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+GA3 0.5mg/L，2%蔗糖，0.6%琼脂组成。
关键词：新葡7号；胚挽救；胚发育；因素
中图分类号 S66 文献标识码 A 1007-7731（2017）14-0058-03
“新葡7号”是新疆主栽品种“无核白”葡萄的芽变品种，2012年8月通过新疆维吾尔自治区农作物品种登记[1]，无核白，果实无核、皮薄、肉脆、汁水多，是深受欢迎的制干和鲜食品种[2]。“新葡7号”果粒较无核白大，无核，早中熟品种，果实品质、产量都优于无核白。胚挽救技术的发展与应用，极大地拓宽了葡萄育种的范围和效率，利用胚挽救技术对本地特色葡萄品种进行改良已成为最有效的途径之一。本研究旨在应用胚挽救技术探索适宜“新葡7号”的培养基及最佳取样接种时期等影响因素，以期进一步提高选育新的无核葡萄品种的效率。
1 材料与方法
1.1 试验材料 2015—2017年在新疆生产建设兵团第十三师农业科学研究所组织培养室内进行。
1.2 研究方法
1.2.1 物候期观察 “新葡7号”在新疆生产建设兵团第十三师现代农业示范园区进行，较本地无核白葡萄提前10～15d，4月中旬萌芽，5月中旬开花，8月上旬成熟，生育期110d。
1.2.2 幼果重量及胚珠的生长变化 开花后20d，每隔5d取样1次，采集的幼果样品带回实验室，随机抽取30粒果粒测定幼果重及胚珠重量和纵横径，确定最佳取样时间。
1.2.3 胚珠培养 发育培养基以MS、ER、Nitach为基本培养基，附加GA及IBA、6-BA等激素，筛选出适于“新葡7号”胚挽救的最佳幼胚发育培养基、IBA浓度。萌发培养基Nitsch+IBA 1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+GA 0.5mg/L，2% 蔗糖，0.6% 琼脂组成，确定最佳胚珠处理方式。
1.2.4 接种 接种方式参照王跃进等[3]的方法。先用自来水将果穗冲洗30～45min，然后用70%酒精浸泡30～60s，无菌水冲洗3～4次，再将果穗放入0.1%升汞中浸泡6～8min，再用无菌水漂洗4～6次，将消毒后的果粒切开，取出胚珠，接种于内装50mL培养基的150mL的培养瓶中，每瓶接种20枚胚珠，每处理5瓶，置培养室中培养。培养条件为：温度25±1℃，光照强度为2000Lx，每天照明12～14h。胚珠培养60～70d后将胚珠进行切喙或横切处理，转移至萌发培养基中继续培养。
1.3 数据统计 统计发育胚珠数和萌发胚珠数，以胚珠转绿、膨大为发育胚珠，褐化干枯的为未发育。胚珠萌发率（%）=（萌发胚珠数/接种胚珠数）×100。试验数据用SPSS程序进行邓肯氏新复极差法测验差异显著性。
2 结果与分析
2.1 不同取样时间对离体胚培养的影响 6月5日开始（开花后20d），每隔5d取样1次，采集的幼果样品带回实验室，随机抽取30粒果粒测量的幼果及胚珠重量和纵、横径。再对自然授粉的果穗取样培养。结果表明（图1、图2）：幼果重、胚珠纵横径随着时间呈现不断增大的趋势，到6月20日（开花后35d）胚珠质量、纵径、横径达到最大值，分别为8.1mg，0.462cm，0.217cm；6月25日（开花后40d）后幼果重量保持增長趋势，而胚珠质量、纵横径出现降低趋势。说明在幼果生长到一定程度，胚珠出现生长停止和减缓的趋势。根据数据显示，胚珠在这个时间处于败育时期。
将不同时期采集的幼果进行胚培养，结果表明（表1），胚珠发育率最高出现在6月15日（开花后30d），发育率为30%，胚珠质量为5.1mg；30d后随着幼果重量不断增大，胚珠发育率呈现降低的趋势，6月20日（开花后35d），胚珠发育率14%，重量达到8.1mg。胚珠在开花后30d之内保持最高的发育率，说明6月15日为“新葡7号”葡萄胚挽救最佳取样时期。
2.2 不同培养基与激素对胚培养的影响 对“新葡7号”葡萄的胚发育培养的结果表明（表2），发育培养基以MS、ER、Nitach为基本培养基，分别接种300粒胚珠，3种发育培养基Nitach和BR培养基差异不显著，Nitach培养基的发育率最高，为60.2%，BR培养基发育率次之，为57.3%，MS培养基发育率为25.7%，较Nitach、BR培养基差异显著。说明Nitach培养基更优于BR、MS培养基，更适合运用于“新葡7号”葡萄的胚挽救研究。
2.3 不同激素浓度、不同处理方式对胚发育的影响 在基本培养基中添加不同浓度IBA生长调节剂对胚发育的影响，结果表明（表3）：生长调节剂IBA的不同浓度对胚珠的发育产生显著的影响，IBA浓度在1mg/L的胚珠发育率较高，为61.7%，IBA浓度在0.51mg/L和1.51mg/L的胚珠发育率低于浓度为1mg/L。
2.4 不同处理方式对胚萌发的影响 通过不同培养基、不同浓度的IBA对“新葡7号”葡萄胚珠进行培养得到发育胚，按横切和切喙的方式对发育胚进行处理后继续培养30d得到正常苗。根据结果表明（表4）：2种处理方式得到的萌发率较不做处理的萌发率高，经过横切的胚珠萌发率为42.9%，经过切喙的胚珠萌发率为62。8%，不做处理的只有6%。说明胚珠经过处理后可以提高胚的萌发率，使用切喙的方式进行处理发育胚得到高的萌发率。
4 结论与讨论
4.1 取样时时间对胚生长发育的影响 研究胚生长发育的过程，确定胚珠接种的最佳时期是胚挽救成功的前提。唐冬梅发现在较晚的时期接种，胚发育的程度越高，培养效果更好，成苗率较高，在早期，胚的发育程度低，离体培养胚不易成活[4]。王跃进等对5个种内和种间杂交组合及3个自然授粉的无核品种研究表明，不同品种及杂交组合胚挽救的最佳取材时期一般介于授粉后20～50d[5]。掌握最佳的接种时期是提高胚珠培养成功率的关键。研究表明“新葡7号”葡萄幼果重、胚珠重量和纵横径随着时间呈现不断增大的趋势，开花后30d胚珠发育率到达最大值，而开花后35d胚珠质量、纵横径达到最大值，开花后40d胚珠重量、纵横径显现降低趋势，与前人研究不同。郝燕等认为最佳接种时间要根据各品种的胚珠发育状况来确定，通常在胚珠重量最大期来确定[6]。而本项目的研究胚珠发育率到达最大值后的第5天的胚珠质量、纵横径达到最大值。因此，确定最佳采样时间不能只考虑胚珠重量，而是考虑品种、气候等综合因素。 4.2 影响葡萄胚培养的主要因素 葡萄胚培养常用的基本培养基有ER[7]、MS、Nitach[8]、B5[9]、1/2MS[10]。本研究试料为“新葡7号”，Nitach培养基更优于BR、MS培养基，更适合运用于“新葡7号”葡萄的胚挽救研究。这与夏培蓓研究白木纳格葡萄胚挽救的结果一致[11]。生长素是影响胚珠发育的重要激素，生长素的主要作用是促进细胞生长，本项目选用IBA作为试料，结果表明IBA浓度在1mg/L的胚珠发育率较高，为61.7%。适合的IBA浓度会促进“新葡7号”胚珠发育，浓度过低起不到促进作用，过高又会抑制发育。胚珠经过处理后可以提高胚的萌发率，使用切喙的方式进行处理发育胚得到高的萌发率。通过以上研究，确定了30d为“新葡7号”最佳取样时间，最佳胚珠发育体系为Nitsch培养基+IBA 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+GA3 0.5mg/L，2%蔗糖，0.6%琼脂组成。
参考文献
[1]郑新疆，吴婷，王建春，等.无核白葡萄大粒芽变新品种新葡7号的选育[J].中国果树，2013（2）：7-8.
[2]李志超，廖可璜，杨忠信.吐鲁番葡萄[M].乌鲁木齐：新疆人民出版社，1988.
[3]王跃进，江淑平，刘小宁，等.假单性结实无核葡萄胚败育机理研究[J]. 西北植物学报，2007（10）.
[4]唐冬梅.无核葡萄胚挽救育种技术研究及种质创建[D].杨凌西北農林科技大学，2005.
[5]王跃进，张剑侠，李桂荣，等.采用胚挽救技术获得抗病无核葡萄新材料的研究[J].甘肃农业大学学报，2001，36（专辑）：105-111.
[6]郝燕，王发林，杨瑞，等.无核葡萄胚败育时期的确定及接种时间对胚萌发的影响[J].甘肃农业大学学报，2006，（4）：45-48.
[7]郭印山，郭修武，张海娥，等.利用胚挽救获得三倍体葡萄植株研究[J].沈阳农业大学学报，2005，36（5）：606- 608.
[8]赵密珍，苏家乐，钱亚明，等.红宝石无核葡萄胚珠培养成苗技术研究[J].果树学报，2005，22（3）：166-168.
[9]朱林，李佩芬，卢炳芝，等.无核葡萄品种的胚珠培养和胚分化[J].植物生理学通讯，1992，28（4）：273-274.
[10]李桂荣，王跃进，唐冬梅，等.无核白胚挽救育种技术研究[J].西北植物学报，2001，21（3）：432-436.
[11]夏培蓓，伍新宇，罗淑萍，等.白木纳格葡萄败育型胚珠培养研究[J].新疆农业科学，2011，48（6）. （责编：张宏民）
关键词：新葡7号；胚挽救；胚发育；因素
中图分类号 S66 文献标识码 A 1007-7731（2017）14-0058-03
“新葡7号”是新疆主栽品种“无核白”葡萄的芽变品种，2012年8月通过新疆维吾尔自治区农作物品种登记[1]，无核白，果实无核、皮薄、肉脆、汁水多，是深受欢迎的制干和鲜食品种[2]。“新葡7号”果粒较无核白大，无核，早中熟品种，果实品质、产量都优于无核白。胚挽救技术的发展与应用，极大地拓宽了葡萄育种的范围和效率，利用胚挽救技术对本地特色葡萄品种进行改良已成为最有效的途径之一。本研究旨在应用胚挽救技术探索适宜“新葡7号”的培养基及最佳取样接种时期等影响因素，以期进一步提高选育新的无核葡萄品种的效率。
1 材料与方法
1.1 试验材料 2015—2017年在新疆生产建设兵团第十三师农业科学研究所组织培养室内进行。
1.2 研究方法
1.2.1 物候期观察 “新葡7号”在新疆生产建设兵团第十三师现代农业示范园区进行，较本地无核白葡萄提前10～15d，4月中旬萌芽，5月中旬开花，8月上旬成熟，生育期110d。
1.2.2 幼果重量及胚珠的生长变化 开花后20d，每隔5d取样1次，采集的幼果样品带回实验室，随机抽取30粒果粒测定幼果重及胚珠重量和纵横径，确定最佳取样时间。
1.2.3 胚珠培养 发育培养基以MS、ER、Nitach为基本培养基，附加GA及IBA、6-BA等激素，筛选出适于“新葡7号”胚挽救的最佳幼胚发育培养基、IBA浓度。萌发培养基Nitsch+IBA 1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+GA 0.5mg/L，2% 蔗糖，0.6% 琼脂组成，确定最佳胚珠处理方式。
1.2.4 接种 接种方式参照王跃进等[3]的方法。先用自来水将果穗冲洗30～45min，然后用70%酒精浸泡30～60s，无菌水冲洗3～4次，再将果穗放入0.1%升汞中浸泡6～8min，再用无菌水漂洗4～6次，将消毒后的果粒切开，取出胚珠，接种于内装50mL培养基的150mL的培养瓶中，每瓶接种20枚胚珠，每处理5瓶，置培养室中培养。培养条件为：温度25±1℃，光照强度为2000Lx，每天照明12～14h。胚珠培养60～70d后将胚珠进行切喙或横切处理，转移至萌发培养基中继续培养。
1.3 数据统计 统计发育胚珠数和萌发胚珠数，以胚珠转绿、膨大为发育胚珠，褐化干枯的为未发育。胚珠萌发率（%）=（萌发胚珠数/接种胚珠数）×100。试验数据用SPSS程序进行邓肯氏新复极差法测验差异显著性。
2 结果与分析
2.1 不同取样时间对离体胚培养的影响 6月5日开始（开花后20d），每隔5d取样1次，采集的幼果样品带回实验室，随机抽取30粒果粒测量的幼果及胚珠重量和纵、横径。再对自然授粉的果穗取样培养。结果表明（图1、图2）：幼果重、胚珠纵横径随着时间呈现不断增大的趋势，到6月20日（开花后35d）胚珠质量、纵径、横径达到最大值，分别为8.1mg，0.462cm，0.217cm；6月25日（开花后40d）后幼果重量保持增長趋势，而胚珠质量、纵横径出现降低趋势。说明在幼果生长到一定程度，胚珠出现生长停止和减缓的趋势。根据数据显示，胚珠在这个时间处于败育时期。
将不同时期采集的幼果进行胚培养，结果表明（表1），胚珠发育率最高出现在6月15日（开花后30d），发育率为30%，胚珠质量为5.1mg；30d后随着幼果重量不断增大，胚珠发育率呈现降低的趋势，6月20日（开花后35d），胚珠发育率14%，重量达到8.1mg。胚珠在开花后30d之内保持最高的发育率，说明6月15日为“新葡7号”葡萄胚挽救最佳取样时期。
2.2 不同培养基与激素对胚培养的影响 对“新葡7号”葡萄的胚发育培养的结果表明（表2），发育培养基以MS、ER、Nitach为基本培养基，分别接种300粒胚珠，3种发育培养基Nitach和BR培养基差异不显著，Nitach培养基的发育率最高，为60.2%，BR培养基发育率次之，为57.3%，MS培养基发育率为25.7%，较Nitach、BR培养基差异显著。说明Nitach培养基更优于BR、MS培养基，更适合运用于“新葡7号”葡萄的胚挽救研究。
2.3 不同激素浓度、不同处理方式对胚发育的影响 在基本培养基中添加不同浓度IBA生长调节剂对胚发育的影响，结果表明（表3）：生长调节剂IBA的不同浓度对胚珠的发育产生显著的影响，IBA浓度在1mg/L的胚珠发育率较高，为61.7%，IBA浓度在0.51mg/L和1.51mg/L的胚珠发育率低于浓度为1mg/L。
2.4 不同处理方式对胚萌发的影响 通过不同培养基、不同浓度的IBA对“新葡7号”葡萄胚珠进行培养得到发育胚，按横切和切喙的方式对发育胚进行处理后继续培养30d得到正常苗。根据结果表明（表4）：2种处理方式得到的萌发率较不做处理的萌发率高，经过横切的胚珠萌发率为42.9%，经过切喙的胚珠萌发率为62。8%，不做处理的只有6%。说明胚珠经过处理后可以提高胚的萌发率，使用切喙的方式进行处理发育胚得到高的萌发率。
4 结论与讨论
4.1 取样时时间对胚生长发育的影响 研究胚生长发育的过程，确定胚珠接种的最佳时期是胚挽救成功的前提。唐冬梅发现在较晚的时期接种，胚发育的程度越高，培养效果更好，成苗率较高，在早期，胚的发育程度低，离体培养胚不易成活[4]。王跃进等对5个种内和种间杂交组合及3个自然授粉的无核品种研究表明，不同品种及杂交组合胚挽救的最佳取材时期一般介于授粉后20～50d[5]。掌握最佳的接种时期是提高胚珠培养成功率的关键。研究表明“新葡7号”葡萄幼果重、胚珠重量和纵横径随着时间呈现不断增大的趋势，开花后30d胚珠发育率到达最大值，而开花后35d胚珠质量、纵横径达到最大值，开花后40d胚珠重量、纵横径显现降低趋势，与前人研究不同。郝燕等认为最佳接种时间要根据各品种的胚珠发育状况来确定，通常在胚珠重量最大期来确定[6]。而本项目的研究胚珠发育率到达最大值后的第5天的胚珠质量、纵横径达到最大值。因此，确定最佳采样时间不能只考虑胚珠重量，而是考虑品种、气候等综合因素。 4.2 影响葡萄胚培养的主要因素 葡萄胚培养常用的基本培养基有ER[7]、MS、Nitach[8]、B5[9]、1/2MS[10]。本研究试料为“新葡7号”，Nitach培养基更优于BR、MS培养基，更适合运用于“新葡7号”葡萄的胚挽救研究。这与夏培蓓研究白木纳格葡萄胚挽救的结果一致[11]。生长素是影响胚珠发育的重要激素，生长素的主要作用是促进细胞生长，本项目选用IBA作为试料，结果表明IBA浓度在1mg/L的胚珠发育率较高，为61.7%。适合的IBA浓度会促进“新葡7号”胚珠发育，浓度过低起不到促进作用，过高又会抑制发育。胚珠经过处理后可以提高胚的萌发率，使用切喙的方式进行处理发育胚得到高的萌发率。通过以上研究，确定了30d为“新葡7号”最佳取样时间，最佳胚珠发育体系为Nitsch培养基+IBA 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+GA3 0.5mg/L，2%蔗糖，0.6%琼脂组成。
参考文献
[1]郑新疆，吴婷，王建春，等.无核白葡萄大粒芽变新品种新葡7号的选育[J].中国果树，2013（2）：7-8.
[2]李志超，廖可璜，杨忠信.吐鲁番葡萄[M].乌鲁木齐：新疆人民出版社，1988.
[3]王跃进，江淑平，刘小宁，等.假单性结实无核葡萄胚败育机理研究[J]. 西北植物学报，2007（10）.
[4]唐冬梅.无核葡萄胚挽救育种技术研究及种质创建[D].杨凌西北農林科技大学，2005.
[5]王跃进，张剑侠，李桂荣，等.采用胚挽救技术获得抗病无核葡萄新材料的研究[J].甘肃农业大学学报，2001，36（专辑）：105-111.
[6]郝燕，王发林，杨瑞，等.无核葡萄胚败育时期的确定及接种时间对胚萌发的影响[J].甘肃农业大学学报，2006，（4）：45-48.
[7]郭印山，郭修武，张海娥，等.利用胚挽救获得三倍体葡萄植株研究[J].沈阳农业大学学报，2005，36（5）：606- 608.
[8]赵密珍，苏家乐，钱亚明，等.红宝石无核葡萄胚珠培养成苗技术研究[J].果树学报，2005，22（3）：166-168.
[9]朱林，李佩芬，卢炳芝，等.无核葡萄品种的胚珠培养和胚分化[J].植物生理学通讯，1992，28（4）：273-274.
[10]李桂荣，王跃进，唐冬梅，等.无核白胚挽救育种技术研究[J].西北植物学报，2001，21（3）：432-436.
[11]夏培蓓，伍新宇，罗淑萍，等.白木纳格葡萄败育型胚珠培养研究[J].新疆农业科学，2011，48（6）. （责编：张宏民）