论文部分内容阅读
摘要 [目的]探讨乙烯反应因子在乙烯转导过程中的重要作用。[方法]克隆石榴ERF1基因，并对其进行序列分析。采用RACE和PCR技术，根据NCBI数据库中已知的ERF基因序列设计特异性引物，最终获得石榴ERF1的cDNA序列。[结果]cDNA序列全长1 612 bp，可编码394个氨基酸。利用BLAST、DNAMAN及其他生物学信息分析软件，对该段序列进行结构分析，结果表明，其包含AP2结构域，并具有典型的ERF基因特点。经氨基酸同源性分析表明，石榴ERF1基因与其他物种ERF基因同源性较高；经系统进化树分析表明，其与欧洲栗、醉蝶花等物种亲缘关系较近。[结论]该研究成功克隆石榴ERF1基因，为后续的下游分析及园艺植物分子育种奠定基础。
关键词 石榴；ERF1；克隆；序列分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-087-03
石榴（Punica granatum L.）为石榴科石榴属多年生落叶乔木或灌木，具有广泛的经济价值，集食用、绿化、药用、观赏于一体。目前国内外关于石榴采后品质变化的研究较少，贮藏环节已成为影响石榴产业发展的瓶颈。乙烯作为控制产后水果质量的主要激素，常作用于果实成熟过程，影响产后贮藏运输。因此，了解乙烯转导途径，并在源头控制乙烯合成，可对石榴生产以及育种工作提供便捷。
乙烯作为植物发育不可或缺的气态激素，它参与种子萌发、植物开花及果实成熟等生理过程。通过遗传和生物化学研究模式植物烟草（Nicotiana tabacum）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等相关突变体，Guo等[1]对乙烯信号感知和信号转导途径中的相关基因进行分离和基因组学研究，建立了乙烯信号转导线性模型。其线性模型主要包含有5个级别元件：乙烯受体（ETRs）、CTR1、EIN2、 EIN3/EILs和乙烯响应因（ERFs）。
ERF（ethylene-response factor）属于植物特有的一个反应因子家族，位于乙烯信号转导途径的下游，含有高度保守的AP2 区域。该结构域由57 个左右氨基酸组成，可形成1 个α-螺旋和3 个反平行链构成的β-折叠结构[2]。ERF基因是EIN3/EIL1的直接作用目标，能够与乙烯诱导基因启动子的GCC-box 结合，其超表达突变体表现出组成性乙烯反应，说明ERF基因是正的转录调控因子[3-5]。目前，在观赏树木方面，人们对于ERF基因研究较少。ERR基因不仅促进果实生长发育，还具有抗病虫害的功能。研究表明，在拟南芥中，乙烯信号转导对于北方根结线虫的侵入有强烈的吸引或者趋避作用，石榴发育过程中的乙烯信号转导对于其他病虫是否同样具有吸引或者趋避作用[6]。
笔者在已知物种ERF基因家族的基础上，以石榴籽粒作为材料，依据ERF基因的保守性，运用RACE及PCR技术克隆石榴ERF1基因完整序列。通过NCBI BLAST以及其他生物学信息分析软件，获得目的基因PgERF1的特异性扩增引物，利用PCR技术克隆全长目的基因。为深入阐明目的基因的结构和功能特征，运用氨基酸序列分析，并经系统树聚类分析表明，目的基因的氨基酸序列与拟南芥等植物的亲缘关系极近，表明该研究克隆的PgERF1基因属于同一类ERF 家族成员，以期为后续分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料采自安徽怀远，品种名“玉石籽”。试验所需RNA提取试剂、PCR反应体系所需试剂以及琼脂糖电泳试剂分别购自GenStar公司、TaKaRa公司和上海生工生物有限公司。
1.2 引物设计
从NCBI中获取桃、拟南芥以及欧洲栗等已知物种ERF基因序列，使用DNAMAN找出同源性较高序列，并通过Primer Primer 5设计扩增引物。引物序列：上游引物5′-TAAGTCAAACCCACCGAAGC-3′，下游引物5′-CTGAGAATCAAATGCCGAGA-3′。
1.3 总RNA的提取及cDNA的合成
选取色泽度较好的成熟果实籽粒，置于4 ℃下预冷72 h，随后用液氮速冻后于-70 ℃冰箱备用。随后进行石榴籽粒总RNA的提取（采用GenStar公司的StarSpin植物RNA小量提取试剂盒提取），以提取的石榴籽粒总RNA为模板进行反转录，合成cDNA第一链。
1.4 基因中间片段的获得
利用PCR技术，将设计引物与模板结合，获得目的基因同源片段。PCR反应体系：cDNA模板1 μL，Mix 10 μL，dH2O 7 μL，上下游引物各1 μL，总体积20 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 PCR扩增与序列拼接
根据获得的基因中间片段核苷酸序列，设计用于5′端克隆的基因特异性引物，利用PCR技术扩增各基因5′端，获得5′端的基因序列。随后，设计用于3′端克隆的特异性引物，并对其进行扩增，获得3′端基因序列。将已获得的目的基因片段、3′端基因序列和5′端基因序列进行拼接，最终获得基因的cDNA全长序列。
2 结果与分析
2.1 PgERF1的全长基因扩增
用设计的特异性引物进行PCR目的片段的扩增，经回收、连接转化后，挑取阳性克隆测序得到一个511 bp的核酸片段（图1A），NCBI序列比对结果显示，该片段序列与欧洲栗（Castanea sativa）的CsERF12（Accession：JF755969.1）序列一致性为87%，初步判断该片段为石榴ERF1基因序列片段。 2.2 PgERF1的5′-RACE
利用特异性扩增引物获得ERF1基因的5′端序列，测序得到一个长864 bp的片段（图1B），NCBI序列对比结果显示，该片段与欧洲栎（Quercus robur）的QrERF1（Accession：KR152259.1）的一致性高达83%，说明已经克隆得到石榴ERF1基因cDNA的5′端序列。
2.3 PgERF1的3′-RACE
经特异性扩增获得ERF1基因的3′端序列，测序得到一个长563 bp的片段（图1C），其3′端发现终止密码子TGA和PolyA尾巴，说明以达到3′末端。NCBI序列对比结果显示，该片段与其白梨（Pyrus bretschneideri）PbERF12（Accession：XP_009357932.1）的一致性为67%，且3′端序列与同源片段部分重叠，确认其为石榴ERF1基因的3′端序列。
2.4 PgERF1基因分析
将试验所得的基因序列放入NCBI数据库中，利用ORF Finder及DNAMAN对其进行分析，结果见图2。由图2可知，所得基因具有完整的开放阅读框，全长cDNA为1 612 bp，其中包含3′非编码区287 bp和开放阅读框1 185 bp，5′非编码区140 bp，编码394个氨基酸的蛋白质。蛋白质分子量约为43.86 ku，等电点为4.97。通过NCBI数据库进行序列比对，证明PgERF1基因具有与其他物种相似的功能序列，具有典型的AP2/ERF结构域。将其与拟南芥等物种进行比对，构建进化树以及聚类图谱，结果表明，两者功能结构域大致相同。表明其具有控制乙烯反应转录因子的相似功能[7]。
2.5 氨基酸同源性分析
将所得的PgERF1基因序列放入NCBI数据库中，对其进行氨基酸序列推导。其序列与欧洲栗、欧洲栎等同源程度高达83%。系统进化树表明，其亲缘关系与麻风树、醉蝶花等物种较近，初步判定克隆得到的基因为石榴ERF1基因（图3）。
3 讨论
ERF 位于乙烯信号转导途径的下游，可以特异性地结合于核心序列为GCCGCC 的GCC-box顺式作用元件上，而GCC-box存在于很多乙烯诱导的生物胁迫和非生物胁迫反应基因的启动子区域[8]。对于植物特有的ERF，通常包含一个高度保守的AP2区域，AP2/ERF功能域可以与DNA结合作为一个单体。此功能域约由57 个氨基酸组成，具有高度亲和力。而拟南芥APETALA2 相似蛋白中含有2 个AP2 区域。研究表明，已发现的ERF基因仅存在于高等植物中，与乙烯、抗病、抗冻等信号传递过程有关，且调控与乙烯、抗病有关基因的转录和表达[9-10]。目前，国内外关于植物乙烯反应因子的研究较少，其作为乙烯信号转导过程中的重要转录因子，能否通过控制其基因表达而影响乙烯作用仍待考证。
该研究以石榴籽粒为材料，运用RACE及PCR技术获得石榴ERF1基因完整序列。通过NCBI BLAST及其他生物学信息分析软件，获得目的基因PgERF的特异性扩增引物，利用PCR技术获得全长目的基因。通过氨基酸序列分析表明，PpERF1与欧洲栗、欧洲栎以及醉蝶花等物种在DNA 结合功能域的约57 个氨基酸中，同源性达85%。系统树聚类分析表明PgERF1基因氨基酸序列与拟南芥等植物的亲缘关系极近。由此证明，该研究获得的PgERF1基因属于同一类ERF 家族成员。
在现有基础上，该研究将进一步发掘PgERF1基因在石榴果实发育和成熟过程中的基因表达特性，以期为石榴的果实发育以及分子育种等提供理论依据。
4 结论
乙烯作为重要的植物激素，在果实发育以及成熟阶段扮演着重要角色。目前，由于石榴贮藏参数难以确定，贮藏保鲜问题已成为影响石榴推广和发展的一大难题。因此，乙烯作为控制产后水果质量的主要激素，了解其转导途径，并在源头控制乙烯合成可有效地解决石榴贮期存在的问题，对提高果实品质和经济效益、保护和发展我国石榴产业具有重要的意义。同时，ERF基因不仅参与乙烯信号转导途径，同样作用于抗病、抗冻等生理胁迫信号。ERF基因作为AP2功能结构域重要的转导因子，其功能和结果仍待鉴定。因此，该 研究选择石榴作为研究材料，成功克隆石榴乙烯反应因子，为进一步控制乙烯转导途径以及抗性信号转导奠定基础。
参考文献
[1]GUO H W，ECKER J R.The ethylene signaling pathway： New insights[J].Current opinion in plant biology，2004， 7（1）：40-49.
[2]别蓓蓓.黄瓜乙烯信号转导途径相关基因的克隆分析及黄瓜遗传转化体系研究[D].上海：上海交通大学，2014.
[3]ALLEN M D，YAMASAKI K，OHME-TAKAGI M，et al.A novel mode of DNA recognition by a beta-sheet revealed by the solution structure of the GCC box binding domain in complex with DNA[J].EMBO journal，1998，17：5484-5496.
[4]殷学仁.猕猴桃果实后熟进程中乙烯信号转导元件功能及其对非生物胁迫的应答[D].杭州：浙江大学，2009.
[5]OHME-TAKAGI M，SHINSHI H.Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element[J].Plant cell，1995，7：173-182.
[6]张秋平，杨宇红，茆振川，等.辣椒乙烯反应转录因子基因CaJERF1的克隆及诱导表达[J].园艺学报，2012，39（4）：705-712.
[7]TRAINOTTI L，PAVANELLO A，CASADORO G.Different ethylene receptors show an increased expression during the ripening of strawberries：Does such an increment imply a role for ethylene in the ripening of these non-climacteric fruits[J].Journal of experimental botany，2005，56（418）：2037-2046.
[8]赵相娟，张静，魏绍冲.桃果实乙烯反应因子PpERF1基因的克隆及序列分析[J].中国农学通报，2009，25（8）：38-41.
[9]高蓝，卢静雯.栀子ERF基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达[J].生物技术通报，2012（7）：60-65.
[10]张杰，杨炜茹，张启翔.梅花乙烯反应转录因子基因ERF克隆及序列分析[M]//张启翔.中国观赏园艺研究进展.北京：中国林业出版社，2012：181-185.
关键词 石榴；ERF1；克隆；序列分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-087-03
石榴（Punica granatum L.）为石榴科石榴属多年生落叶乔木或灌木，具有广泛的经济价值，集食用、绿化、药用、观赏于一体。目前国内外关于石榴采后品质变化的研究较少，贮藏环节已成为影响石榴产业发展的瓶颈。乙烯作为控制产后水果质量的主要激素，常作用于果实成熟过程，影响产后贮藏运输。因此，了解乙烯转导途径，并在源头控制乙烯合成，可对石榴生产以及育种工作提供便捷。
乙烯作为植物发育不可或缺的气态激素，它参与种子萌发、植物开花及果实成熟等生理过程。通过遗传和生物化学研究模式植物烟草（Nicotiana tabacum）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等相关突变体，Guo等[1]对乙烯信号感知和信号转导途径中的相关基因进行分离和基因组学研究，建立了乙烯信号转导线性模型。其线性模型主要包含有5个级别元件：乙烯受体（ETRs）、CTR1、EIN2、 EIN3/EILs和乙烯响应因（ERFs）。
ERF（ethylene-response factor）属于植物特有的一个反应因子家族，位于乙烯信号转导途径的下游，含有高度保守的AP2 区域。该结构域由57 个左右氨基酸组成，可形成1 个α-螺旋和3 个反平行链构成的β-折叠结构[2]。ERF基因是EIN3/EIL1的直接作用目标，能够与乙烯诱导基因启动子的GCC-box 结合，其超表达突变体表现出组成性乙烯反应，说明ERF基因是正的转录调控因子[3-5]。目前，在观赏树木方面，人们对于ERF基因研究较少。ERR基因不仅促进果实生长发育，还具有抗病虫害的功能。研究表明，在拟南芥中，乙烯信号转导对于北方根结线虫的侵入有强烈的吸引或者趋避作用，石榴发育过程中的乙烯信号转导对于其他病虫是否同样具有吸引或者趋避作用[6]。
笔者在已知物种ERF基因家族的基础上，以石榴籽粒作为材料，依据ERF基因的保守性，运用RACE及PCR技术克隆石榴ERF1基因完整序列。通过NCBI BLAST以及其他生物学信息分析软件，获得目的基因PgERF1的特异性扩增引物，利用PCR技术克隆全长目的基因。为深入阐明目的基因的结构和功能特征，运用氨基酸序列分析，并经系统树聚类分析表明，目的基因的氨基酸序列与拟南芥等植物的亲缘关系极近，表明该研究克隆的PgERF1基因属于同一类ERF 家族成员，以期为后续分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料采自安徽怀远，品种名“玉石籽”。试验所需RNA提取试剂、PCR反应体系所需试剂以及琼脂糖电泳试剂分别购自GenStar公司、TaKaRa公司和上海生工生物有限公司。
1.2 引物设计
从NCBI中获取桃、拟南芥以及欧洲栗等已知物种ERF基因序列，使用DNAMAN找出同源性较高序列，并通过Primer Primer 5设计扩增引物。引物序列：上游引物5′-TAAGTCAAACCCACCGAAGC-3′，下游引物5′-CTGAGAATCAAATGCCGAGA-3′。
1.3 总RNA的提取及cDNA的合成
选取色泽度较好的成熟果实籽粒，置于4 ℃下预冷72 h，随后用液氮速冻后于-70 ℃冰箱备用。随后进行石榴籽粒总RNA的提取（采用GenStar公司的StarSpin植物RNA小量提取试剂盒提取），以提取的石榴籽粒总RNA为模板进行反转录，合成cDNA第一链。
1.4 基因中间片段的获得
利用PCR技术，将设计引物与模板结合，获得目的基因同源片段。PCR反应体系：cDNA模板1 μL，Mix 10 μL，dH2O 7 μL，上下游引物各1 μL，总体积20 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 PCR扩增与序列拼接
根据获得的基因中间片段核苷酸序列，设计用于5′端克隆的基因特异性引物，利用PCR技术扩增各基因5′端，获得5′端的基因序列。随后，设计用于3′端克隆的特异性引物，并对其进行扩增，获得3′端基因序列。将已获得的目的基因片段、3′端基因序列和5′端基因序列进行拼接，最终获得基因的cDNA全长序列。
2 结果与分析
2.1 PgERF1的全长基因扩增
用设计的特异性引物进行PCR目的片段的扩增，经回收、连接转化后，挑取阳性克隆测序得到一个511 bp的核酸片段（图1A），NCBI序列比对结果显示，该片段序列与欧洲栗（Castanea sativa）的CsERF12（Accession：JF755969.1）序列一致性为87%，初步判断该片段为石榴ERF1基因序列片段。 2.2 PgERF1的5′-RACE
利用特异性扩增引物获得ERF1基因的5′端序列，测序得到一个长864 bp的片段（图1B），NCBI序列对比结果显示，该片段与欧洲栎（Quercus robur）的QrERF1（Accession：KR152259.1）的一致性高达83%，说明已经克隆得到石榴ERF1基因cDNA的5′端序列。
2.3 PgERF1的3′-RACE
经特异性扩增获得ERF1基因的3′端序列，测序得到一个长563 bp的片段（图1C），其3′端发现终止密码子TGA和PolyA尾巴，说明以达到3′末端。NCBI序列对比结果显示，该片段与其白梨（Pyrus bretschneideri）PbERF12（Accession：XP_009357932.1）的一致性为67%，且3′端序列与同源片段部分重叠，确认其为石榴ERF1基因的3′端序列。
2.4 PgERF1基因分析
将试验所得的基因序列放入NCBI数据库中，利用ORF Finder及DNAMAN对其进行分析，结果见图2。由图2可知，所得基因具有完整的开放阅读框，全长cDNA为1 612 bp，其中包含3′非编码区287 bp和开放阅读框1 185 bp，5′非编码区140 bp，编码394个氨基酸的蛋白质。蛋白质分子量约为43.86 ku，等电点为4.97。通过NCBI数据库进行序列比对，证明PgERF1基因具有与其他物种相似的功能序列，具有典型的AP2/ERF结构域。将其与拟南芥等物种进行比对，构建进化树以及聚类图谱，结果表明，两者功能结构域大致相同。表明其具有控制乙烯反应转录因子的相似功能[7]。
2.5 氨基酸同源性分析
将所得的PgERF1基因序列放入NCBI数据库中，对其进行氨基酸序列推导。其序列与欧洲栗、欧洲栎等同源程度高达83%。系统进化树表明，其亲缘关系与麻风树、醉蝶花等物种较近，初步判定克隆得到的基因为石榴ERF1基因（图3）。
3 讨论
ERF 位于乙烯信号转导途径的下游，可以特异性地结合于核心序列为GCCGCC 的GCC-box顺式作用元件上，而GCC-box存在于很多乙烯诱导的生物胁迫和非生物胁迫反应基因的启动子区域[8]。对于植物特有的ERF，通常包含一个高度保守的AP2区域，AP2/ERF功能域可以与DNA结合作为一个单体。此功能域约由57 个氨基酸组成，具有高度亲和力。而拟南芥APETALA2 相似蛋白中含有2 个AP2 区域。研究表明，已发现的ERF基因仅存在于高等植物中，与乙烯、抗病、抗冻等信号传递过程有关，且调控与乙烯、抗病有关基因的转录和表达[9-10]。目前，国内外关于植物乙烯反应因子的研究较少，其作为乙烯信号转导过程中的重要转录因子，能否通过控制其基因表达而影响乙烯作用仍待考证。
该研究以石榴籽粒为材料，运用RACE及PCR技术获得石榴ERF1基因完整序列。通过NCBI BLAST及其他生物学信息分析软件，获得目的基因PgERF的特异性扩增引物，利用PCR技术获得全长目的基因。通过氨基酸序列分析表明，PpERF1与欧洲栗、欧洲栎以及醉蝶花等物种在DNA 结合功能域的约57 个氨基酸中，同源性达85%。系统树聚类分析表明PgERF1基因氨基酸序列与拟南芥等植物的亲缘关系极近。由此证明，该研究获得的PgERF1基因属于同一类ERF 家族成员。
在现有基础上，该研究将进一步发掘PgERF1基因在石榴果实发育和成熟过程中的基因表达特性，以期为石榴的果实发育以及分子育种等提供理论依据。
4 结论
乙烯作为重要的植物激素，在果实发育以及成熟阶段扮演着重要角色。目前，由于石榴贮藏参数难以确定，贮藏保鲜问题已成为影响石榴推广和发展的一大难题。因此，乙烯作为控制产后水果质量的主要激素，了解其转导途径，并在源头控制乙烯合成可有效地解决石榴贮期存在的问题，对提高果实品质和经济效益、保护和发展我国石榴产业具有重要的意义。同时，ERF基因不仅参与乙烯信号转导途径，同样作用于抗病、抗冻等生理胁迫信号。ERF基因作为AP2功能结构域重要的转导因子，其功能和结果仍待鉴定。因此，该 研究选择石榴作为研究材料，成功克隆石榴乙烯反应因子，为进一步控制乙烯转导途径以及抗性信号转导奠定基础。
参考文献
[1]GUO H W，ECKER J R.The ethylene signaling pathway： New insights[J].Current opinion in plant biology，2004， 7（1）：40-49.
[2]别蓓蓓.黄瓜乙烯信号转导途径相关基因的克隆分析及黄瓜遗传转化体系研究[D].上海：上海交通大学，2014.
[3]ALLEN M D，YAMASAKI K，OHME-TAKAGI M，et al.A novel mode of DNA recognition by a beta-sheet revealed by the solution structure of the GCC box binding domain in complex with DNA[J].EMBO journal，1998，17：5484-5496.
[4]殷学仁.猕猴桃果实后熟进程中乙烯信号转导元件功能及其对非生物胁迫的应答[D].杭州：浙江大学，2009.
[5]OHME-TAKAGI M，SHINSHI H.Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element[J].Plant cell，1995，7：173-182.
[6]张秋平，杨宇红，茆振川，等.辣椒乙烯反应转录因子基因CaJERF1的克隆及诱导表达[J].园艺学报，2012，39（4）：705-712.
[7]TRAINOTTI L，PAVANELLO A，CASADORO G.Different ethylene receptors show an increased expression during the ripening of strawberries：Does such an increment imply a role for ethylene in the ripening of these non-climacteric fruits[J].Journal of experimental botany，2005，56（418）：2037-2046.
[8]赵相娟，张静，魏绍冲.桃果实乙烯反应因子PpERF1基因的克隆及序列分析[J].中国农学通报，2009，25（8）：38-41.
[9]高蓝，卢静雯.栀子ERF基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达[J].生物技术通报，2012（7）：60-65.
[10]张杰，杨炜茹，张启翔.梅花乙烯反应转录因子基因ERF克隆及序列分析[M]//张启翔.中国观赏园艺研究进展.北京：中国林业出版社，2012：181-185.