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摘 要：本文以GB/T 20756-2006检测标准为基础，在试验前处理和上机测定方面优化了可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素残留检测的液相色谱-串联质谱法。样本在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液吹干后，残渣用水溶解，经正己烷液分配脱脂后，过0.22 μm滤膜上机，采用电喷雾电离负离子模式，多反应监测（MRM）模式进行测定。0.1 μg/L、0.3 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L等6个浓度的标准曲线相关系数r=0.997 1，方法检出限确定为0.04 μg/kg，0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg等3个加标试验变异系数分别为6.45 %、14.38 %、10.34 %，回收率范围分别为70.00 %～80.00 %、76.00 %～108.00 %、86.00 %～108.00 %，具有较好的精密度和准确度。通过回收率和多种食品样本的实测实验证明：上述方法样本前处理方法简便、快捷、易操作，液相色谱串联质谱的条件设置合理，相关参数优化较佳，灵敏度较高，可准确进行定性、定量检测，适用于检测可食动物肌肉、肝脏以及水产品中的氯霉素残留。
关键词：氯霉素；检测方法；优化
中图分类号：S859.79 6 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）07-0066-03
氯霉素是由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素，白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，味苦，在甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇中易溶，在干燥时稳定，在弱酸性和中性溶液中较安定，煮沸也不见分解，遇碱类易失效，属抑菌性广谱抗生素。敏感菌有肠杆菌科细菌及炭疽杆菌、肺炎球菌、链球菌、李斯特氏菌等；衣原体、钩端螺旋体、立克次体也对本品敏感。用于治疗由伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、流感杆菌、布氏杆菌、肺炎球菌等所引起感染的抗菌作用机制是与核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成。
氯霉素对造血系统有严重的不良反应。由于氯霉素引发的再生障碍性贫血是非剂量依赖的，美国FDA认为：不可能通过建立允许残留量和休药期来控制氯霉素残留的危害。也就是说，氯霉素的残留量不论为多少都可认为对人体健康是有害的。近年来，鉴于氯霉素对公众健康可能造成的危害问题日益严重，世界各国和组织纷纷加强了对食品中氯霉素残留的控制。2002年年初起，动物源性食品氯霉素残留问题给中国的食品出口带来极大的影响。欧盟宣布：“自2002年l月31日起禁止从中国进口供人类消费或用作动物饲料的动物源性产品。”使我国当年在欧盟市场丢掉13万t水产品的市场份额和造成6亿多美元的经济损失。同年2月7日，英国以氯霉素超标为由停止销售中国蜂蜜。欧盟其他国家纷纷效仿，以抗生素残留超标为由将中国蜂蜜挡在国门之外，同时美国、日本、加拿大等其他国家相继提高了对中国动物源性食品中药物残留的检出限量。中华人民共和国农业部于2002年4月9日颁布了《中华人民共和国农业部公告 第193号》，其中食品生产用动物禁用的兽药及其他化合物清单中就包含了氯霉素及其盐、酯制剂。而氯霉素残留的检测方法目前报道的有很多，主要有以下几种：金标试纸条法、酶联免疫分析法、放射性免疫分析法、微生物法、气相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等等。
其中，高效液相色谱-电喷雾-串联四级杆质谱（HPLC-MS/MS）法具有灵敏度较高、可准确定性定量、操作更方便、受环境影响较小等优点，如在GB/T 20756-2006、GB/T 22338-2008检测标准中均使用此方法，氯霉素的检出限可达到0.1 μg/kg。经过不断探索和试验，我们在《GB/T 20756-2006 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》的基础上，对其前处理操作及仪器参数方面都进行了优化，具体如下：
1 仪器与主要试剂
1.1 所用仪器
液相色谱串联质谱联用仪Waters AcQuity UPLC / XoVo TQMS，百位电子天平，离心机，氮吹仪。
1.2 主要试剂
氯霉素及氯霉素-D5标准品（Sigma公司），乙酸乙酯（色谱纯），氨水，无水硫酸钠（经600 ℃、3 h烘干）。正己烷（色谱纯）滤膜（津腾：0.22 μm，有机相），二次蒸馏水等。
2 试验方法
称取5 g试样，精确至0.01 g。置于50 mL离心管中，加入适量内标工作液（氯霉素-D5），加入20 mL乙酸乙酯，0.5 mL氨水，5 g无水硫酸钠涡旋60 s，震荡15 min，以8 000 r/min离心5 min，取上清液4 mL，45 ℃氮气吹干。 1 mL水复溶，加4 mL正己烷，涡旋30 s，以5 000 r/min离心3 min，去上层正己烷，再重复一次。过0.22 μm有机相滤膜，上机测定。
3 上机测定
液相色谱及质谱条件：
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm， 3.0 mm×100 mm）或相当者；
柱温：40 ℃；
流动相：甲醇 水（40 60）；
流速：0.300 mL/min；
进样量：5.0 μL；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：负离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM）；
电喷雾电压：-1 750 V；
辅助气温度：500 ℃；
定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表1。
4 试验结果
4.1 标准曲线
按方法条件设置仪器参数，配制一系列浓度的标准样本溶液（0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.5 μg/L，1.0 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L），待仪器基线稳定后，对系列标准样本溶液进行测定，绘制标准曲线（图1），其相关系数r=0.997 1。 4.2 方法检出限确定
以空白鸡肉样本为基质，添加浓度为0.1 μg/kg，按照上述方法全过程进行预处理和测定，平行样本n=7，根据各样本检测值（0.09 μg/kg、0.09 μg/kg、0.10 μg/kg， 0.10 μg/kg、0.10 μg/kg、0.08 μg/kg、0.11 μg/kg），计算出平均值X（0.096 μg/kg）及标准偏差Sb（0.012 9），当被分析物的回收率在70 %～120 %之间时，可计算检出限为0.04 μg/kg。计算公式如下：
检出限（MDL）=（k×Sb×C）/X
其中：k为置信因子，一般取3。
4.3 方法精密度和回收率实验
以空白鸡肉样本为基质，进行加标回收试验，加标浓度分别为0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg（图2）。将加标样本和空白样本按前述方法进行处理，上机测试，结果见表2、表3和表4。
5 结果与结论
经过60次的反复比较试验，与《GB/T 20756-2006》相比较，在前处理步骤方面：本方法把匀质提取步骤代之以15 min充分振荡提取，同样可满足原方法要求。在振荡充分的前提下，由于提取液最终只需分取五分之一，则提取过程只需一次即可满足原方法要求。在净化方面，去脂的过程不在于正己烷量的多少，而在于净化的次数，1 mL正己烷重复一次即可。这些优化过程，既能满足原方法要求，又节约了检测时间及试剂耗材。
优化参数如下：一系列浓度的标准样本溶液（0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.5 μg/L，1.0 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L）的标准曲线相关系数r=0.997 1；方法检出限确定为0.04 μg/kg，亦能达到GB/T 20756-2006、GB/T 22338-2008检测标准方法中氯霉素的检出限；0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg加标试验变异系数分别为 6.45 %、14.38 %、10.34 %， 0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg加标试验回收率范围分别为70.00 %～80.00 %、76.00 %～108.00 %、86.00 %～ 108.00 %，具有较好的精密度和准确度。通过回收率和多种食品样本的60次实测实验证明：上述方法样本前处理方法简便、快捷、易操作，液相色谱串联质谱的条件设置合理，相关参数优化较佳，灵敏度较高，可准确进行定性、定量检测，适用于检测可食动物肌肉、肝脏以及水产品中的氯霉素残留。□□
参考文献：（6篇，略）
关键词：氯霉素；检测方法；优化
中图分类号：S859.79 6 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）07-0066-03
氯霉素是由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素，白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，味苦，在甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇中易溶，在干燥时稳定，在弱酸性和中性溶液中较安定，煮沸也不见分解，遇碱类易失效，属抑菌性广谱抗生素。敏感菌有肠杆菌科细菌及炭疽杆菌、肺炎球菌、链球菌、李斯特氏菌等；衣原体、钩端螺旋体、立克次体也对本品敏感。用于治疗由伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、流感杆菌、布氏杆菌、肺炎球菌等所引起感染的抗菌作用机制是与核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成。
氯霉素对造血系统有严重的不良反应。由于氯霉素引发的再生障碍性贫血是非剂量依赖的，美国FDA认为：不可能通过建立允许残留量和休药期来控制氯霉素残留的危害。也就是说，氯霉素的残留量不论为多少都可认为对人体健康是有害的。近年来，鉴于氯霉素对公众健康可能造成的危害问题日益严重，世界各国和组织纷纷加强了对食品中氯霉素残留的控制。2002年年初起，动物源性食品氯霉素残留问题给中国的食品出口带来极大的影响。欧盟宣布：“自2002年l月31日起禁止从中国进口供人类消费或用作动物饲料的动物源性产品。”使我国当年在欧盟市场丢掉13万t水产品的市场份额和造成6亿多美元的经济损失。同年2月7日，英国以氯霉素超标为由停止销售中国蜂蜜。欧盟其他国家纷纷效仿，以抗生素残留超标为由将中国蜂蜜挡在国门之外，同时美国、日本、加拿大等其他国家相继提高了对中国动物源性食品中药物残留的检出限量。中华人民共和国农业部于2002年4月9日颁布了《中华人民共和国农业部公告 第193号》，其中食品生产用动物禁用的兽药及其他化合物清单中就包含了氯霉素及其盐、酯制剂。而氯霉素残留的检测方法目前报道的有很多，主要有以下几种：金标试纸条法、酶联免疫分析法、放射性免疫分析法、微生物法、气相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等等。
其中，高效液相色谱-电喷雾-串联四级杆质谱（HPLC-MS/MS）法具有灵敏度较高、可准确定性定量、操作更方便、受环境影响较小等优点，如在GB/T 20756-2006、GB/T 22338-2008检测标准中均使用此方法，氯霉素的检出限可达到0.1 μg/kg。经过不断探索和试验，我们在《GB/T 20756-2006 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》的基础上，对其前处理操作及仪器参数方面都进行了优化，具体如下：
1 仪器与主要试剂
1.1 所用仪器
液相色谱串联质谱联用仪Waters AcQuity UPLC / XoVo TQMS，百位电子天平，离心机，氮吹仪。
1.2 主要试剂
氯霉素及氯霉素-D5标准品（Sigma公司），乙酸乙酯（色谱纯），氨水，无水硫酸钠（经600 ℃、3 h烘干）。正己烷（色谱纯）滤膜（津腾：0.22 μm，有机相），二次蒸馏水等。
2 试验方法
称取5 g试样，精确至0.01 g。置于50 mL离心管中，加入适量内标工作液（氯霉素-D5），加入20 mL乙酸乙酯，0.5 mL氨水，5 g无水硫酸钠涡旋60 s，震荡15 min，以8 000 r/min离心5 min，取上清液4 mL，45 ℃氮气吹干。 1 mL水复溶，加4 mL正己烷，涡旋30 s，以5 000 r/min离心3 min，去上层正己烷，再重复一次。过0.22 μm有机相滤膜，上机测定。
3 上机测定
液相色谱及质谱条件：
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm， 3.0 mm×100 mm）或相当者；
柱温：40 ℃；
流动相：甲醇 水（40 60）；
流速：0.300 mL/min；
进样量：5.0 μL；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：负离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM）；
电喷雾电压：-1 750 V；
辅助气温度：500 ℃；
定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表1。
4 试验结果
4.1 标准曲线
按方法条件设置仪器参数，配制一系列浓度的标准样本溶液（0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.5 μg/L，1.0 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L），待仪器基线稳定后，对系列标准样本溶液进行测定，绘制标准曲线（图1），其相关系数r=0.997 1。 4.2 方法检出限确定
以空白鸡肉样本为基质，添加浓度为0.1 μg/kg，按照上述方法全过程进行预处理和测定，平行样本n=7，根据各样本检测值（0.09 μg/kg、0.09 μg/kg、0.10 μg/kg， 0.10 μg/kg、0.10 μg/kg、0.08 μg/kg、0.11 μg/kg），计算出平均值X（0.096 μg/kg）及标准偏差Sb（0.012 9），当被分析物的回收率在70 %～120 %之间时，可计算检出限为0.04 μg/kg。计算公式如下：
检出限（MDL）=（k×Sb×C）/X
其中：k为置信因子，一般取3。
4.3 方法精密度和回收率实验
以空白鸡肉样本为基质，进行加标回收试验，加标浓度分别为0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg（图2）。将加标样本和空白样本按前述方法进行处理，上机测试，结果见表2、表3和表4。
5 结果与结论
经过60次的反复比较试验，与《GB/T 20756-2006》相比较，在前处理步骤方面：本方法把匀质提取步骤代之以15 min充分振荡提取，同样可满足原方法要求。在振荡充分的前提下，由于提取液最终只需分取五分之一，则提取过程只需一次即可满足原方法要求。在净化方面，去脂的过程不在于正己烷量的多少，而在于净化的次数，1 mL正己烷重复一次即可。这些优化过程，既能满足原方法要求，又节约了检测时间及试剂耗材。
优化参数如下：一系列浓度的标准样本溶液（0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.5 μg/L，1.0 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L）的标准曲线相关系数r=0.997 1；方法检出限确定为0.04 μg/kg，亦能达到GB/T 20756-2006、GB/T 22338-2008检测标准方法中氯霉素的检出限；0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg加标试验变异系数分别为 6.45 %、14.38 %、10.34 %， 0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg加标试验回收率范围分别为70.00 %～80.00 %、76.00 %～108.00 %、86.00 %～ 108.00 %，具有较好的精密度和准确度。通过回收率和多种食品样本的60次实测实验证明：上述方法样本前处理方法简便、快捷、易操作，液相色谱串联质谱的条件设置合理，相关参数优化较佳，灵敏度较高，可准确进行定性、定量检测，适用于检测可食动物肌肉、肝脏以及水产品中的氯霉素残留。□□
参考文献：（6篇，略）