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摘要：本文对青霉素酶对青霉素残留生乳检测结果的影响进行了简要分析。
关键词：青霉素酶“解抗剂”生乳检测
0 引言
乳制品在人们日常生活中占据着日益重要位置的同时其安全问题也越来越引起人们的重视[1]。在众多不安全因素中，抗生素残留由于会造成耐药菌传播，对饮用者身体健康造成不利的影响，已经引起各方关注[2]。目前市场上无抗和有抗奶的收购价差异较大，为了掩盖生乳中的抗生素残留，“解抗剂”也相应有了广泛的市场。所谓“解抗剂”，主要是指β-内酰胺酶类可以选择性分解β-内酰胺类抗生素的一种蛋白。它可以在短时间内分解牛乳中的抗生素残留，使抗生素残留奶通过检测[3]。在实际生产中，很多乳品生产厂家利用抗生素残留检测和乳酸菌类在有抗生素残留的牛乳中不发酵或异常发酵的情况判定生乳是否含有抗生素[1]。那采用“解抗剂”处理过的抗生素残留奶能否通过相应检测呢？本次试验旨在探讨β-内酰胺酶对抗生素残留生乳检测结果的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 ①菌株。藤黄微球菌( Micrococcus Luteus )CMCC(B)28001购自国家医学菌种保藏管理中心。乳酸菌YO-MIX 495 LYO100DCU购自丹尼斯克公司（中国代理）。②试剂与培养基。青霉素钠（4000000U/支），山东鲁抗医药股份有限公司；β-内酰胺酶标准品（4000000U/mL），中国药品生物制品检定所；抗生素快速检测试纸条，twin-sensor。③生乳。无抗生素生乳采自山东银香伟业集团有限公司自控养殖小区。
1.2 方法 ①青霉素溶液配制。用10ml生理盐水完全稀释1支400万单位的青霉素钠，即得到400000U/ml的青霉素溶液。②抗生素残留的检测。取10支试管进行标记，分别加入20ml无抗生素生乳，煮沸5min冷却后在2-10支试管中分别加入1ml青霉素溶液。再向3-10号试管中依次加入不同含量的β-内酰胺酶，立即进行抗生素残留检测。于37℃温育30min再次进行检测。抗生素残留检测按照twin-sensor试剂盒说明书进行。③杯碟法进行β-内酰胺酶的检测[4]。按照下列顺序分别将青霉素标准溶液（0.1mg/mL）、β-内酰胺酶标准溶液（16000U/mL）、舒巴坦标准溶液（1 mg/mL）加入到样品和纯水中：(A)青霉素5μL；(B)舒巴坦25μL、青霉素5μL；(C)β-内酰胺酶25μL、
青霉素G5μL；(D)β-内酰胺酶25μL、舒巴坦25μL、青霉素5μL。并将上述A～D试样各200μL加入放置于培养基上的4个牛津杯中，37℃培养20h后测量抑菌圈直径并对结果进行判定。④生乳发酵。在上述10支试管中分别加入0.6ml乳酸菌，混匀后于42℃水浴发酵。
2 结果
2.1 β-内酰胺酶对青霉素的分解作用 10支生乳加入β-内酰胺酶后立即进行抗生素检测，结果如图1.A所示：1为阴性，2为阳性，3-5为阳性，6为弱阳性，7-10为阴性，此现象说明含量高于等于150万单位的β-内酰胺酶在常温下可以迅速降解40万单位的青霉素。温育30min后，再次对10支试管中的牛奶进行抗生素检测，结果如图1.B所示：1为阴性，2为阳性，3-4为阳性，5为弱阳性，6-10为阴性，此现象说明β-内酰胺酶在适宜的温度条件下水解能力会增强，含量高于等于80万单位的酶在37℃下作用30min可以降解40万单位的青霉素。
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2.2 β-内酰胺酶对抗生素牛奶发酵结果的影响 对10支试管中的乳品进行发酵试验，发酵2.5h，5h，7.5h，10h，24h各对其进行一次观测，发酵结果如表1所示。由图2可以看出：发酵2.5h时1已完全发酵，2-8未发酵，9-10 未完全发酵（图2，B）；发酵5h时1发酵，2、3未发酵，4未完全发酵，5-10 完全发酵（图2，C）；7.5h时，1发酵，2未发酵，3未完全发酵，4-10 完全发酵（图2，D）；10h和24h时，除阳性对照2未发酵，其他样品均已完全发酵（图2，E，F）。
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2.3 β-内酰胺酶的检测 采用杯碟法对无抗生素生乳1号样品与经β-内酰胺酶分解过的抗生素生乳5号样品进行β-内酰胺酶的检测，同时用纯水作为对照，其检测结果如图3所示：
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经过对抑菌圈的测量，可以看出5号样品中(B)和(D)均产生抑菌圈，且(C)与(D)抑菌圈差异在3mm以上(含3mm)时，(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差异在3mm以上(含3mm)即5号检出β-内酰胺酶；1号样品中(A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差异小于3mm，说明未添加有β-内酰胺酶，结果与前期试验吻合。
3 讨论
3.1 牛奶抗生素快速检测和发酵试验的结果显示 在添加抗生素的牛奶中加入β-内酰胺酶进行分解后，添加过抗生素的生乳可以通过抗生素快速检测并完成发酵试验。这说明β-内酰胺酶对抗生素残留奶的掩蔽作用比较明显，只通过抗生素检测和发酵试验并不能真正意义上杜绝抗生素残留奶，因此乳品企业在实际工作中不能只采用抗生素快速检测和牛奶发酵试验的方法对牛奶中是否添加抗生素进行判定，还需要辅以其他检测手段，尤其要加强对β-内酰胺酶等解抗剂的检测[5]。
3.2 畜牧业在近年来迅速发展，牛奶作为营养最全面、消化率最高、钙含量丰富的食品之一，受到消费者的欢迎[6]，同时其质量及其安全性也倍受关注。牛奶中残留抗生素会危害饮用者身体健康，而非法添加解抗剂掩蔽牛奶中的抗生素可能助长牛奶生产中β-内酰胺类抗生素的滥用，这会加速耐药菌的传播[7]，与人体直接滥用抗生素的危害类似，甚至更加严重。因此，我们不但要关注牛奶中的抗生素残留，更要加强对“解抗剂”的关注，严把质量关，带给消费者真正健康、安全的乳品。
参考文献：
[1]曹亢，曹雪，任发政.牛奶中抗生素残留检测方法的研究进展及展望[J].中国乳业，2009(09).
[2]孟静，王锐，祝建华.生鲜牛乳中抗生素检测方法的新问题[J].中国乳品工业，2010(9).
[3]孟静，王锐.霍胜楠等.分解酶对牛乳中抗生素检测的影响[J].食品研究与开发，2011(6).
[4]米自由，苏亮，何义刚等.生鲜牛乳中l3一内酰胺酶检测方法一杯碟法的优化及应用[J].中国兽医杂志，2010(1).
[5]张鑫潇，谢岩黎，王金水等.牛乳中β-内酰胺酶的检测方法研究进展[J].中国乳品工业，2011(2).
[6]郑靖宇.牛乳营养价值浅析[J].农民致富之友，2011(20).
[7]Essack S Y，Hall L M，Pillay D G，et a1.Complexity and diversity of Klebsiella pneumoniae strains with extended-spectrmn beta-lacta2 mases isolated in 1994 and 1996 at a teaching hospital in Durban，South Africa[J].Antimicrob Agents Chemother，2001(1).
关键词：青霉素酶“解抗剂”生乳检测
0 引言
乳制品在人们日常生活中占据着日益重要位置的同时其安全问题也越来越引起人们的重视[1]。在众多不安全因素中，抗生素残留由于会造成耐药菌传播，对饮用者身体健康造成不利的影响，已经引起各方关注[2]。目前市场上无抗和有抗奶的收购价差异较大，为了掩盖生乳中的抗生素残留，“解抗剂”也相应有了广泛的市场。所谓“解抗剂”，主要是指β-内酰胺酶类可以选择性分解β-内酰胺类抗生素的一种蛋白。它可以在短时间内分解牛乳中的抗生素残留，使抗生素残留奶通过检测[3]。在实际生产中，很多乳品生产厂家利用抗生素残留检测和乳酸菌类在有抗生素残留的牛乳中不发酵或异常发酵的情况判定生乳是否含有抗生素[1]。那采用“解抗剂”处理过的抗生素残留奶能否通过相应检测呢？本次试验旨在探讨β-内酰胺酶对抗生素残留生乳检测结果的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 ①菌株。藤黄微球菌( Micrococcus Luteus )CMCC(B)28001购自国家医学菌种保藏管理中心。乳酸菌YO-MIX 495 LYO100DCU购自丹尼斯克公司（中国代理）。②试剂与培养基。青霉素钠（4000000U/支），山东鲁抗医药股份有限公司；β-内酰胺酶标准品（4000000U/mL），中国药品生物制品检定所；抗生素快速检测试纸条，twin-sensor。③生乳。无抗生素生乳采自山东银香伟业集团有限公司自控养殖小区。
1.2 方法 ①青霉素溶液配制。用10ml生理盐水完全稀释1支400万单位的青霉素钠，即得到400000U/ml的青霉素溶液。②抗生素残留的检测。取10支试管进行标记，分别加入20ml无抗生素生乳，煮沸5min冷却后在2-10支试管中分别加入1ml青霉素溶液。再向3-10号试管中依次加入不同含量的β-内酰胺酶，立即进行抗生素残留检测。于37℃温育30min再次进行检测。抗生素残留检测按照twin-sensor试剂盒说明书进行。③杯碟法进行β-内酰胺酶的检测[4]。按照下列顺序分别将青霉素标准溶液（0.1mg/mL）、β-内酰胺酶标准溶液（16000U/mL）、舒巴坦标准溶液（1 mg/mL）加入到样品和纯水中：(A)青霉素5μL；(B)舒巴坦25μL、青霉素5μL；(C)β-内酰胺酶25μL、
青霉素G5μL；(D)β-内酰胺酶25μL、舒巴坦25μL、青霉素5μL。并将上述A～D试样各200μL加入放置于培养基上的4个牛津杯中，37℃培养20h后测量抑菌圈直径并对结果进行判定。④生乳发酵。在上述10支试管中分别加入0.6ml乳酸菌，混匀后于42℃水浴发酵。
2 结果
2.1 β-内酰胺酶对青霉素的分解作用 10支生乳加入β-内酰胺酶后立即进行抗生素检测，结果如图1.A所示：1为阴性，2为阳性，3-5为阳性，6为弱阳性，7-10为阴性，此现象说明含量高于等于150万单位的β-内酰胺酶在常温下可以迅速降解40万单位的青霉素。温育30min后，再次对10支试管中的牛奶进行抗生素检测，结果如图1.B所示：1为阴性，2为阳性，3-4为阳性，5为弱阳性，6-10为阴性，此现象说明β-内酰胺酶在适宜的温度条件下水解能力会增强，含量高于等于80万单位的酶在37℃下作用30min可以降解40万单位的青霉素。
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2.2 β-内酰胺酶对抗生素牛奶发酵结果的影响 对10支试管中的乳品进行发酵试验，发酵2.5h，5h，7.5h，10h，24h各对其进行一次观测，发酵结果如表1所示。由图2可以看出：发酵2.5h时1已完全发酵，2-8未发酵，9-10 未完全发酵（图2，B）；发酵5h时1发酵，2、3未发酵，4未完全发酵，5-10 完全发酵（图2，C）；7.5h时，1发酵，2未发酵，3未完全发酵，4-10 完全发酵（图2，D）；10h和24h时，除阳性对照2未发酵，其他样品均已完全发酵（图2，E，F）。
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2.3 β-内酰胺酶的检测 采用杯碟法对无抗生素生乳1号样品与经β-内酰胺酶分解过的抗生素生乳5号样品进行β-内酰胺酶的检测，同时用纯水作为对照，其检测结果如图3所示：
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经过对抑菌圈的测量，可以看出5号样品中(B)和(D)均产生抑菌圈，且(C)与(D)抑菌圈差异在3mm以上(含3mm)时，(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差异在3mm以上(含3mm)即5号检出β-内酰胺酶；1号样品中(A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差异小于3mm，说明未添加有β-内酰胺酶，结果与前期试验吻合。
3 讨论
3.1 牛奶抗生素快速检测和发酵试验的结果显示 在添加抗生素的牛奶中加入β-内酰胺酶进行分解后，添加过抗生素的生乳可以通过抗生素快速检测并完成发酵试验。这说明β-内酰胺酶对抗生素残留奶的掩蔽作用比较明显，只通过抗生素检测和发酵试验并不能真正意义上杜绝抗生素残留奶，因此乳品企业在实际工作中不能只采用抗生素快速检测和牛奶发酵试验的方法对牛奶中是否添加抗生素进行判定，还需要辅以其他检测手段，尤其要加强对β-内酰胺酶等解抗剂的检测[5]。
3.2 畜牧业在近年来迅速发展，牛奶作为营养最全面、消化率最高、钙含量丰富的食品之一，受到消费者的欢迎[6]，同时其质量及其安全性也倍受关注。牛奶中残留抗生素会危害饮用者身体健康，而非法添加解抗剂掩蔽牛奶中的抗生素可能助长牛奶生产中β-内酰胺类抗生素的滥用，这会加速耐药菌的传播[7]，与人体直接滥用抗生素的危害类似，甚至更加严重。因此，我们不但要关注牛奶中的抗生素残留，更要加强对“解抗剂”的关注，严把质量关，带给消费者真正健康、安全的乳品。
参考文献：
[1]曹亢，曹雪，任发政.牛奶中抗生素残留检测方法的研究进展及展望[J].中国乳业，2009(09).
[2]孟静，王锐，祝建华.生鲜牛乳中抗生素检测方法的新问题[J].中国乳品工业，2010(9).
[3]孟静，王锐.霍胜楠等.分解酶对牛乳中抗生素检测的影响[J].食品研究与开发，2011(6).
[4]米自由，苏亮，何义刚等.生鲜牛乳中l3一内酰胺酶检测方法一杯碟法的优化及应用[J].中国兽医杂志，2010(1).
[5]张鑫潇，谢岩黎，王金水等.牛乳中β-内酰胺酶的检测方法研究进展[J].中国乳品工业，2011(2).
[6]郑靖宇.牛乳营养价值浅析[J].农民致富之友，2011(20).
[7]Essack S Y，Hall L M，Pillay D G，et a1.Complexity and diversity of Klebsiella pneumoniae strains with extended-spectrmn beta-lacta2 mases isolated in 1994 and 1996 at a teaching hospital in Durban，South Africa[J].Antimicrob Agents Chemother，2001(1).